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牛α S1casein-人tPA杂合基因座的构建及在小鼠乳腺中表达的鉴定

作　者: 吕月蒙
导　师: 陈昭烈；陈红星
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 细菌人工染色体 Gap-repair 牛αS1酪蛋白基因组织型纤溶酶原激活剂
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是一种内源性的丝氨酸蛋白水解酶,主要由血管内皮细胞生成并分泌到循环系统中,在人体的正常组织和体液中广泛存在,在血浆中的浓度约为7.1ng/mL。在纤维蛋白的存在下,tPA能将纤溶酶原激活为纤溶酶,从而使血栓纤维蛋白水解,消除血栓。被广泛用来治疗心梗、冠状血栓、肺血栓以及急性缺血性中风等心血管疾病,是目前FDA批准的唯一治疗急性缺血性脑中风的溶栓药。由于血栓性疾病一跃成为危害人类健康的首要因素,tPA市场需求很大,但是价格非常昂贵,市售的tPA价格可以达到2900元/20mg。用传统的基因工程方法生产tPA又有诸多缺点,如在细菌和酵母中生产的tPA虽价格便宜但质量达不到要求;动物细胞培养方法生产的tPA由于生产成本很高,虽然质量可以保证,但是由于tPA的使用剂量大,导致其使用也受到了很大限制。因此,在美国、英国等发达国家首先开始了用乳腺生物反应器制备tPA的研究,并获得了成功。目前由美国GTC公司采用乳腺生物反应器制备的重组人tPA已进入三期临床。动物乳腺生物反应器即用于在乳腺中生产具有生物活性物质的转基因动物,将某种具有重要价值的生物活性蛋白的基因导入动物受精卵中培养出转基因动物,使外源基因在动物乳腺中表达并分泌到乳汁中,从而在乳汁中提取目的蛋白产物。然而从长期的文献报道来看,利用动物乳腺生物反应器真正获得rhtPA高表达的例子很少。主要的原因在于表达载体构建不良。为了解决高效表达载体的设计问题,我们提出了杂合基因座表达载体的构建思路,也即将乳蛋白基因座内的基因组编码序列从起始密码子到终止密码子精确地置换为待表达目标基因(如tPA)的基因组编码序列,从而形成一种杂合基因座,在杂合基因座的两端是乳蛋白基因座完善的5’和3’表达调控序列,而中间是待表达目标基因的基因组编码序列。对于这个组装方案,我们认为在理论上具有如下的几个优势:1)杂合基因座内包含了较长的5’和3’表达调控序列,尽可能长的含有了丰富的重要调控元件。2)使用待表达基因的基因组编码序列而不是cDNA序列更符合真核基因天然的组织状态。已有大量证据证明:使用基因组编码序列更有利于高效表达。3)乳蛋白基因座的上下游表达调控序列和待表达基因的基因组序列之间实现了无缝连接,没有任何的多余碱基插入和碱基删除,最大限度的模拟了天然的乳蛋白基因座。在本文中,我们选择牛αS1酪蛋白基因座作为表达调控序列,和人tPA的基因组编码序列一起,构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。为了实现上述杂合基因座的构建,我们采用了本实验室发明的连续三次基因抓捕技术,首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构建成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含牛αS1-caseinBAC的细菌人工染色体上亚克隆了9Kb的牛αS1-casein基因3’端侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从人tPABAC上亚克隆从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的17.4Kb的人tPA基因组序列;第三步,从牛αS1-caseinBAC上亚克隆20Kb的牛αS1-casein基因5’端侧翼序列,并使这三个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约46.4Kb的牛αS1-casein-人tPA杂合基因座。经过PCR扩增、酶切鉴定和测定序列验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来牛αS1-casein基因座中牛αS1-casein基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换的目的。将构建好的牛αS1casein-人tPA杂合基因座通过显微注射的方法整合到小鼠的受精卵中,通过PCR和Southern-blot鉴定,证实获得了三个转基因小鼠系。进一步的westernblot、ELISA鉴定证实了htPA在转基因小鼠乳汁中的表达,转基因小鼠乳汁中htPA的表达量最高为0.247g/L。我们的结果表明:构建的牛αS1casein-人tPA杂合基因座可以在小鼠模型上有效的表达重组人tPA,研究工作为日后大型动物乳腺生物反应器的制备准备了有效的表达调控序列。

牛α S1casein-人tPA杂合基因座的构建及在小鼠乳腺中表达的鉴定

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