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基于BAC同源重组技术构建小鼠胚胎干细胞Nanog基因报告体系及其鉴定

作　者: 范彦
导　师: 邹方东
学　校: 四川大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小鼠胚胎干细胞 自我更新 Nanog EGFP 细菌人工染色体 同源重组
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)具有的自我更新(self-renew)及多向分化潜能(multipotential)两大特性，是细胞移植治疗手段的首选来源，也成为近年研究的热门领域。自ES细胞建系至今，对于ES细胞的研究不仅局限于定向分化条件的摸索，将体细胞去分化(dedifferentiation，重塑其多能性的研究也逐渐成为了热点，因此阐述ES细胞多能性维持的分子机制是对其深入研究的基础。目前研究得知与维持ES细胞多能性相关的因子有LIF／gp130／STAT3，WntBMPs／Smads，PI3K等多条信号通路及OCT4，SOX2，Nanog等多种外源因子。其中同源异型蛋白Nanog是最新发现的一个在维持ES细胞多能性的机制中有重要作用的转录因子。Nanog独立于LIF／Stat3途径及BMPs／Smads途径维持ES细胞的多能性，主要在早期胚胎细胞和ES细胞中表达，并且与OCT4、SOX2的表达存在一定的时序关系。Nanog的表达能非常灵敏的随着ES细胞的分化而下调，成为指示细胞多能性的最理想的标志基因之一。另一方面，基于细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)的同源重组技术是近来广泛应用且稳定的基因打靶载体构建方法。此方法通过同源重组技术从包含有目的基因的BAC上直接套取目的基因，不仅避免了传统构建过程中通过PCR扩增的方法获得目的基因可能带来突变及PCR片段大小的限制，还不受限制酶切位点的局限。本研究旨在运用基于BAC的同源重组技术构建小鼠胚胎干细胞(mES细胞)Nanog基因报告体系。首先挑选包含Nanog基因启动子的BAC，通过同源重组，直接从BAC上套取Nanog启动子。再次同源重组，将报告基因插入Nanog／EGFP插入Nanog基因启动子之后，高效构建了Naong／EGFP打靶载体。通过电穿孔的方法，将打靶载体导入mES细胞系R1中，筛选后获得基因打靶的阳性细胞R5。经鉴定，R5与R1分化前具有相似的基因表达情况；R5与R1具有形成EB(embryonic body)的能力。用RT-PCR分析此两种EB，结果表明，R5及R1所形成的EB均表达内、中、外三个胚层的标志基因SOX17、Nkx2.5及Nestin。由此说明，打靶后的mES细胞R5具有与mES细胞R1相似的特性。同时，用免疫细胞化学的方法对自发分化前后的R5细胞进行OCT4的标染，观察到未分化的R5细胞团EGFP与OCT4共染，而分化后EGFP不表达的部分细胞不被OCT4标染。结果证明此报告体系能稳定的偶联表达Nanog和EGFP，且符合Nanog基因的表达模式。由于此报告体系能通过EGFP有效报告Nanog基因的表达水平，对mES细胞分化或未分化状态作出明显指示，因此为mES细胞自我更新和诱导分化的研究提供了一个理想的实验体系。本实验所构建的mES细胞系不仅能用于优化mES细胞的培养体系，还可以用于研究Nanog的表达调控、Nanog与其他维持mES细胞多能性的因子和途径之间的关系。另外，p1253-Nanog-EGFP载体可以作为良好的报告载体用于小鼠体细胞重编程因子的研究。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
研究部分  10-47
  前言  10-12
  第一章 基于BAC同源重组技术构建打靶载体  12-24
    摘要  12
    1 引言  12-13
    2 材料与方法  13-17
      2.1 材料  13
        2.1.1 质粒和菌株  13
        2.1.2 酶及主要试剂  13
      2.2 方法  13-17
        2.2.1 打靶载体构建流程  13-14
        2.2.2 引物设计与合成  14-15
        2.2.3 同源臂的扩增  15
        2.2.4 重组质粒及EGFP/Kan靶向插入片段的构建  15-16
        2.2.5 转化Nanog-BAC至DY380中  16
        2.2.6 套取Nanog启动子片段  16-17
        2.2.7 EGFP/Kan片段的靶向插入  17
    3 结果  17-19
      3.1 重组质粒的鉴定  17-19
      3.2 套取NANOG启动子的鉴定  19
      3.3 EGFP/KAN片断靶向插入的鉴定  19
    4 讨论  19-21
    参考文献  21-24
  第二章 电转ES细胞及阳性克隆的筛选  24-34
    摘要  24
    1 引言  24
    2 材料与方法  24-31
      2.1 材料  24-25
        2.1.1 细胞  24-25
        2.1.2 主要溶液  25
        2.1.3 溶液配制  25
      2.2 方法  25-31
        2.2.1 胚胎成纤维细胞及饲养层细胞的制备  25-27
        2.2.2 小鼠胚胎干细胞的培养方法  27-28
        2.2.3 打靶载体质粒的大量制备  28-29
        2.2.4 打靶载体的线性化及纯化  29-30
        2.2.5 电穿孔法转染mES细胞  30
        2.2.6 G418富集阳性细胞  30-31
        2.2.7 FACS再次富集阳性细胞  31
    3 结果  31-32
      3.1 FACS富集阳性细胞  31-32
    4 讨论  32-33
    参考文献  33-34
  第三章 mES细胞NANOG基因报告体系的鉴定  34-47
    摘要  34
    1 引言  34-35
    2 材料方法  35-38
      2.1 材料  35
        2.1.1 细胞  35
        2.1.2 主要试剂  35
        2.1.3 溶液配制  35
      2.2 方法  35-38
        2.2.1 RT-PCR检测阳性细胞的基因表达  35-36
        2.2.2 阳性细胞自发分化  36-37
        2.2.3 免疫细胞化学检测自发分化的阳性细胞的表达模式  37
        2.2.4 阳性细胞EB形成  37-38
        2.2.5 RT-PCR检测EB的基因表达  38
    3 结果  38-42
      3.1 RT-PCR检测阳性细胞及其形成的EB的基因表达  38-39
      3.2 阳性细胞分化前后基因表达模式  39-41
      3.3 阳性细胞及R1细胞EB形成  41-42
    4 讨论  42-43
    小结  43-45
    参考文献  45-47
综述部分  47-67
  第四章 小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化的分子机制  47-59
    1 相关信号通路  47-50
      1.1 LIF/Ge130/STAT3信号通路维持MES细胞多能性  47-48
      1.2 WNT信号通路维持MES细胞多能性  48
      1.3 BMPs/SMADS信号通路的抑制维持MES细胞多能性  48-49
      1.4 P13K信号通路促进MES细胞的自我更新  49-50
    2 相关细胞因子  50-55
      2.1 OCT4维持ES细胞多能性  50-51
      2.2 SOX2维持ES细胞多能性  51
      2.3 NANOG维持ES细胞多能性  51-55
        2.3.1 Nanog基因  51
        2.3.2 Nanog的表达模式  51-52
        2.3.3 Nanog过表达及Nanog干扰和敲除  52-53
        2.3.4 Nanog在维持ES细胞多能性的分子机制  53
        2.3.5 Nanog与其他多能性维持因子及信号通路的关系  53-55
    参考文献  55-59
  第五章 基因打靶技术  59-67
    1 基因打靶技术的原理  59-60
    2 基因打靶技术的步骤  60-62
      2.1 打靶载体的构建  60
      2.2 转化受体细胞  60-61
      2.3 阳性细胞筛选和鉴定  61
      2.4 问题及展望  61-62
    3 基于BAC的同源重组  62-65
      3.1 基于BAC的同源重组原理  62-63
      3.2 步骤  63-64
      3.3 应用和前景  64-65
    参考文献  65-67
发表论文  67-69
致谢  69-70

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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