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ABIN1与μ阿片受体功能的相互调节

作　者: 赵钧如
导　师: 宫泽辉; 周培岚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: ABIN1 μ阿片受体相互作用受体功能调节
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

阿片类药物(opioid drug)是临床常用的镇痛药,其反复使用会出现耐受、依赖等中枢不良反应。阿片受体是Gi/Go型GPCR中的一员,激活后与Gi/Go型G蛋白偶联而启动下游的信号转导系统,其在在阿片类药物长期作用后会出现依赖耐受,而其他Gi/Go型GPCR如α2肾上腺素、腺苷A1等在激动剂慢性作用后则无依赖现象出现。近年来,国内外学者为了解释这一现象进行了许多研究,用阿片受体的胞内片段如C-末端筛选直接与阿片受体相互作用的特异性蛋白在该研究领域有一定进展,其中与u阿片受体的相互作用蛋白研究最多的,有钙调蛋白(Calmodulim)、丝蛋白A (Filamin A)、 Periplakin、PKCI、RGS4和PLD2等等。这些蛋白与阿片受体的相互作用使得受体激活后的效应发生了改变,进一步提示阿片受体激活后并非完全局限于与公认的G蛋白偶联,可能有更多或者更加特异性的蛋白参与了阿片受体后的调节。本课题组致力于阿片类药物依赖耐受的机制研究,在前期工作中以u阿片受体C-端为诱饵筛选吗啡依赖大鼠的脑cDNA文库,得到A20结合的核因子抑制蛋白1(ABIN1)。在前期研究中,本实验室通过体外实验及细胞实验已确定ABIN1与μ阿片受体之间存在着相互作用,随后构建了稳定表达μ阿片受体及稳定共表达ABIN1和μ阿片受体的CHO细胞株(μ-CHO-68、μ-ABIN1-CHO-19).并在此基础上进行了一些ABIN1功能实验的研究,结果表明ABIN1蛋白对μ阿片受体与配体结合的亲和力及激动活性能够产生一定的影响。基于以上工作基础,确定本课题的研究目的为：(1)在稳转细胞上探讨ABIN1对μ阿片受体激动活性的调控作用；(2)在整体动物模型上观察依赖状态下大、小鼠不同脑区ABIN1蛋白的表达。第一部分,ABIN1对μ阿片受体磷酸化、内吞及激动活性的影响。蛋白免疫印迹实验结果显示μ-CHO-68细胞可正常表达μ阿片受体,μ-ABIN1-CHO-19细胞可正常表达μ阿片受体及ABIN1蛋白。进行细胞免疫荧光共定位实验,通过激光共聚焦显微镜可以观察到μ-ABIN1-CHO-19细胞μ阿片受体主要分布在细胞膜上,蛋白ABIN1为胞浆胞膜分布,ABIN1和μ阿片受体二者存在共定位。[35S]-GTPyS结合实验结果显示DAMGO对μ-CHO-68与H-ABIN1-CHO-19细胞的μ阿片受体G蛋白激活作用EC50值分别为31.10±12.50、121.71±44.28(nmol/L)(n=5),两者之间存在显著性差异,P<0.01,最大刺激效应(Emax) μ-ABIN1-CHO-19为4.56±1.25(n=5),而μ-CHO-68细胞为6.34±0.91(n=5)。ABIN1过表达可以明显抑制DAMGO对μ阿片受体的激动活性,使量效曲线明显下移右移。用μ阿片受体Ser377磷酸化抗体进行蛋白免疫印迹实验可以检测到,用DAMGO处理细胞后,μ-CHO-68细胞受体的磷酸化明显增强,μ-ABIN1-CHO-19细胞受体的磷酸化虽然也出现上调,但较μ-CHO-68细胞明显降低。ABIN1能够明显抑制受体的磷酸化水平。DAMGO10μ M作用于μ-CHO-68细胞后30分钟,对受体进行细胞免疫荧光定位实验,通过激光共聚焦显微镜可以观察到,较对照未加药细胞μ阿片受体出现了明显内吞,而μ-ABIN1-CHO-19细胞在DAMGO处理后μ阿片受体内吞不明显。表明ABIN1对μ阿片受体激动后的内吞有明显的抑制作用。cAMP是μ阿片受体后信号通路中重要的第二信使分子,对胞内cAMP进行检测,结果表明在两种细胞中,与基础水平相比forskolin诱导的cAMP含量均显著升高,DAMGO能够显著抑制forskolin引起的cAMP升高。ABIN1过表达后,对forskolin刺激的cAMP升高有抑制作用,对DAMGO抑制forskolin刺激的cAMP升高作用也表现出下调。Ca2+是μ阿片受体后信号通路中另一重要分子,吗啡慢性作用后,纳洛酮诱发的Ca2+超射在μ-ABIN1-CHO-19中较μ-CHO-68细胞明显减弱。DAMGO急性刺激引起的p-ERK水平在μ-CHO-68明显上调,在μ-ABIN1-CHO-19细胞上调不明显,与μ-CHO-68相比,p-ERK明显抑制。DAMGO对μ-CHO-68、μ-ABIN1-CHO-19的ERK水平无明显影响。第二部分,整体动物水平观察了对依赖状态下ABIN1蛋白表达变化。首先制备mABIN1的多克隆抗体,用ABIN1特异性序列片段,免疫新西兰大耳白兔,获得ABIN1蛋白的多克隆抗血清。利用ELISA、蛋白免疫印迹检测、免疫荧光检测共同鉴定所得抗血清的特异性,结果表明鼠源ABIN1蛋白341抗血清制备成功。并对抗血清进行纯化,纯化后效价降低但杂带减少。利用上述抗体,通过蛋白免疫印迹发现ABIN1在大鼠皮层、海马、嗅球、纹状体、伏隔核、丘脑、下丘脑、小脑、脑干等部位广泛分布,与mRNA表达水平基本一致。在大鼠吗啡依赖自然戒断模型上,发现ABIN1在大鼠前皮层、海马、纹状体和伏隔核,随着依赖时间的延长出现上调性改变,在自然戒断1、7天达到最高,随着戒断时间的延长,ABIN1又恢复到对照组水平。在小鼠吗啡依赖催促戒断模型,发现在前皮层、海马和纹状体中ABIN1在依赖和戒断状态与各自对照组相比均出现明显上调,随戒断时间的延长有所降低。结论：ABIN1与μ阿片受体相互作用后,能够明显抑制μ阿片受体的激动活性、磷酸化水平及内吞,且对激动剂作用后的cAMP、Ca2+和p-ERK的变化有抑制作用。在吗啡依赖状态下,大、小鼠不同脑区的ABIN1蛋白出现明显上调。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-21
第一章 ABIN1对MOR激动后受体及信号通路的影响  21-49
  材料和方法  21-34
    一实验材料  21-22
    二实验方法  22-34
  实验结果  34-45
    1 建立稳定共转染MOR和蛋白ABIN1(全长)的细胞株  34
    2 稳转细胞中蛋白的表达及共定位的验证  34-36
      2.1 稳转细胞中蛋白表达的验证  34-35
      2.2 稳转细胞中蛋白共定位的验证  35-36
    3 ABIN1对MOR激动后受体的影响  36-39
      3.1 DAMGO-[~(35)S]-GTP γ S结合实验  36-37
      3.2 MOR磷酸化的蛋白免疫印迹检测  37-38
      3.3 激光共聚焦观察MOR的内吞  38-39
    4 ABIN1对MOR激动后受体后信号通路的影响  39-45
      4.1 胞内cAMP浓度检测试验  39-41
      4.2 激光共聚焦测细胞内Ca~(2+)浓度变化实验  41-42
      4.3 ERK/p-ERK的蛋白免疫印迹检测  42-45
  讨论  45-49
第二章吗啡慢性作用对ABIN1蛋白表达的影响  49-73
  材料和方法  49-55
    一实验材料  49-50
    二实验方法  50-55
  实验结果  55-68
    1 ABIN1抗体的制备  55-59
      1.1 免疫肽段  55
      1.2 间接ELISA检测抗血清效价  55-56
      1.3 SDS-PAGE检测抗血清对不同部位ABIN1蛋白的特异性  56-57
      1.4 免疫荧光组织化学检测  57-58
      1.5 抗原亲和纯化341抗血清  58-59
    2 蛋白免疫印迹和RT-PCR实验观察ABIN1在大鼠脑区分布  59-60
      2.1 蛋白免疫印迹实验观察ABIN1在大鼠脑区的分布  59
      2.2 RT-PCR实验观察ABIN1在大鼠脑区分布  59-60
    3 大鼠躯体吗啡依赖自然戒断实验观察不同脑区ABIN1的变化  60-63
    4 小鼠躯体吗啡依赖催促戒断实验观察不同脑区ABIN1的变化  63-68
  讨论  68-73
结论  73-75
参考文献  75-81
综述  81-89
  参考文献  85-89
发表文章  89-101
个人简历  101-103
致谢  103

ABIN1与μ阿片受体功能的相互调节

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