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喹赛多在猪、鸡、鱼和大鼠体内代谢及分布研究

作　者: 胥宁
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 氚标喹赛多代谢分布残留标示物残留靶组织肠道
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

喹赛多是一种喹噁啉类抗菌促生长动物专用药,对畜禽具有明显促生长和保健的作用,且副作用小、安全性高、用药后吸收快、消除迅速、残留期短,有望成为喹噁啉类高效安全的新药。在新药研究中要明确药物有效性和安全性,揭示药理活性成分和毒理作用靶点是关键,药物代谢和分布是基础。目前美国食品和药物管理局(FDA)和欧盟(EU)推荐采用放射性示踪法研究新药的代谢分布。放射性同位素作为示踪剂具有灵敏度高,测量方法简便易行,能准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点,已广泛应用于医药学领域,用以揭示药物的体内分布、代谢与排泄过程。本课题采用放射性示踪技术与液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)技术,开展喹赛多在猪、鸡、鱼和大鼠体内的代谢、分布及排泄研究,发现并鉴定喹赛多在各种动物的代谢物,分析各代谢物在动物体内的分布和消除规律,确定喹赛多在各个动物体内的残留靶组织和残留标示物,分析种属差异,为喹赛多食品安全性标准的制定和药理毒理作用机制的深入探讨提供依据。前期研究发现喹赛多促生长机理和药理活性与肠道环境和代谢有关。喹赛多的生物利用度较低,在肠道中驻留,肠道中的大量的药物代谢酶和细菌代谢酶使喹赛多产生降解,然而代谢物及药理毒理活性尚不清楚。因此,本课题建立体外肠道代谢模型,采用LC/MS-ITTOF技术,开展喹赛多在猪、鸡、鱼和大鼠肠微粒体、肠黏膜和肠道细菌中代谢研究,发现鉴定喹赛多在动物肠道体外模型中代谢物,明确喹赛多在肠道中特有的代谢物分析代谢物不同的产生部位,阐明肠道代谢途径分析种属差异,为代谢物药理和毒理研究提供基础。1喹赛多在动物体内的物料平衡和代谢研究猪、鸡、鱼和大鼠各6头(只),分别一次性灌胃给药(3H喹赛多),给药后每24h收集粪便、尿液、血液和胆汁(鱼检测活动范围内的水),一部分样品消化之后经静态液闪仪测定放射性活度,直到排泄物中放射性检测不到为止,计算氚标喹赛多的排泄情况。一部分样品经提取之后,采用流动液闪仪和HPLC/MS-IT-TOF鉴定代谢产物。猪给药后12天,放射性总共排出96.1%,尿中排出44.5%,粪便中排出51.6%。鸡给药后12天,放射性总共排出95.2%。鱼给药后12天,放射性总共排出97.4%。大鼠给药后12天,放射性总共排出94.5%,尿中排出28.3%,粪便排出66.2%。喹赛多在动物体内主要是通过粪便排出体外,排泄迅速,给药后3天放射性排出可达到90%以上。在猪尿液中检测到原形(Cy0)和13种代谢物,脱氧代谢物Cy1、Cy2和Cy10,氢化代谢物Cy4和Cy9,羟化代谢物Cy7和Cy8,侧链断裂代谢物Cy5、Cy6、Cy11和Cy12,甘氨酸结合物Cy3,水解代谢物Cy13和Cy14；粪便中发现原形(Cy0)和10种代谢物(Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy7、Cy9、Cy11和Cy12);猪血液中检测到11种代谢物(Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy9、 Cy11、Cy12、Cy13和Cy14)；在猪的的胆汁中检测到13种代谢物(Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy7、Cy8、Cy9、Cy11、Cy12、Cy13和Cyl4)。在鸡粪便中检测到原形(Cy0)和7种代谢物(Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6、 Cy7和Cy15),鸡血液中检测到4种代谢物(Cy2、Cy4、Cy5和Cy6),鸡胆汁中检测到原形(Cy0)和7种代谢产物(Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy10、Cy11和Cy13)。在鱼的排泄物中发现了大量的原形(Cy0)和2种代谢物(Cy2和Cy13),鱼血液中检测到3种代谢物(Cy1、Cy2和Cy5)。在大鼠的尿液中检测到6种代谢物(Cy1、Cy4、Cy5、Cy6、Cy9和Cy11)；粪便中检测到原形(Cy0)和7种代谢产物(Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6、Cy11和Cy15)；大鼠血液中检测到5种代谢物(Cy1、Cy4、 Cy5、Cy6和Cy11)。喹赛多在四种动物体内的主要代谢途径为：一是N-O键还原生成脱氧代谢产物；二是发生侧链C=N键的断裂,发生羟化和氧化；三是发生C=N键的氢化；四是发生酰胺键的水解。Cy3(Cy6甘氨酸结合物)只在猪体内发现：在鸡和大鼠体内发现了Cy15,在猪和鱼中没有检测到。四种动物中,鱼的代谢能力最差,在排泄物中能够检测到大量的原形和两种代谢物。通过喹赛多在不同种属动物体内的代谢研究,分析种属差异,对药理活性成分和代谢物毒性研究具有重要的指导意义。2喹赛多在动物体内的分布和残留消除24头猪(36只大鼠)随机分为6组,30只鸡(30尾鱼)随机分为5组,连续7天灌胃给药(3H喹赛多),在给药后6小时(h)、1天(d)、3d、7d、14d和21d宰杀(鸡和鱼为6h、1d、3d、7d和14d),取血液、胆汁、肝脏、肺脏、脾脏、皮肤、胃、大肠、小肠、肾脏等组织,消化液(solvable)水浴消化,经液闪仪检测放射活度测定药物在体内各组织中的分布情况；利用乙腈、乙酸乙酯和碱解法对可食性组织样品进行提取、净化,测定提取液放射活度计算提取率,然后进行LC/MS-IT-TOF流动液闪进行代谢物分离鉴定和定量。喹赛多在猪体内广泛分布。给药后6h,肝、胆汁、肾和消化道中药物浓度高,胆汁中浓度超过14mg/kg。脂肪中浓度最低,只有0.9mg/kg。24h,大多数组织的放射性活度只有6h的一半左右,3d,绝大多数组织的浓度已下降到0.5mg/kg以下。7d,大部分组织中的浓度接近或低于0.1mg/kg,一些组织已不能检出。14d,只有肝和肾中能检出少量药物。6h猪的肝中能检测到8种代谢物,分别为Cy1、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy9、Cy11和Cy12,7d时只检测到了Cy1。6h猪肾中检测到8种代谢物,分别是Cy1、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6、Cy9、Cy11和Cy12。7d时只能检出Cy1。6h猪肌肉能检出8种代谢物,分别是Cy1、Cy3、 Cy4、Cy5、Cy6、Cy9、Cy11和Cy12。3天也只检出Cy3。6h猪脂肪中可检出6种代谢物Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5和Cy6。肌肉、脂肪、肠道和血液中药物消除最快,消除半衰期为0.5～0.6d。其次为脾、肺、胃和肾上腺,消除速度相近,消除半衰期分别为1.08d～1.53d。肝脏和肾脏中药物消除速度较慢,消除半衰期分别为2.39d和2.57d。总放射性检测结果显示,喹赛多及其代谢物在肾脏中残留量最高,持续时间最长,消除速度最慢,因此肾脏是残留靶组织。猪肾中Cyl消除最慢,消除半衰期2.67d,与总残留相近,总体消除趋势相似,因此Cy1被确定为残留标示物。喹赛多在鸡组织中分布广泛。给药后6h,胆汁、肝脏、肾脏和消化道的药物浓度高,胆汁中浓度甚至超过15mg/kg。脂肪中浓度最低,只有1.0mg/kg。24h,大多数组织的药物浓度下降到0.4mg/kg以下,但胆汁中浓度高达2.56mg/kg。3d,除肾和小肠外,其他组织中浓度均在0.2mg/kg。7d,只有肝脏和肾脏中有少量药物检出。6h鸡肝中检出原形和6种代谢物,分别是Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6和Cy15。7d只检测到Cyl。6h,鸡肾脏检测到原形和6种代谢物,分别是Cy1、 Cy2、Cy4、Cy5、Cy6和Cy15。7d也只检测到Cy1。6h,鸡肌肉中检出原形和4种代谢物,分别是Cy1、Cy4、Cy5和Cy6。肌肉、脂肪、大肠、肺、肌胃和肾上腺消除最快,消除半衰期在0.63-0.67天之间。脾、小肠和血液次之,消除半衰期在0.73-0.95d之间。以上组织消除半衰期比较接近,都没有超过1d。肝脏和肾脏中药物消除速度较慢,消除半衰期分别为1.39d和2.38d。喹赛多及其代谢物在肾脏中残留量最高,持续时间最长,消除速度最慢,因此肾脏是残留靶组织。鸡肾中,Cyl消除最慢,消除半衰期3.15d,与总残留相近,总体消除趋势相似,因此Cyl被确定为残留标示物。喹赛多在鱼体内广泛分布。给药后6h,肝、脾、肾和消化道中药物浓度高。脂肪中浓度最低,只有0.32mg/kg。24h,大多数组织的放射性活度下降迅速,大部分都在1.0mg/kg以下,但肝、肾和消化道中的浓度仍然较高,肠中的浓度仍在1.6mg/kg以上。3d,绝大多数组织的浓度已下降到0.5mg/kg以下。7d,只有肝和肠道中能检出少量药物。6h,鱼肝中检出5种代谢物,分别为Cy1、Cy2、 Cy4、Cy5和Cy10,并检测到原形药物。7d只检测到Cy1。6h,鱼肾脏检测到了6种代谢物,分别为Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6和Cy10,并检测到原形药物。3d只检测到Cyl。6h,鱼肌肉检测到4种代谢物,分别为Cy1、Cy2、Cy4和Cy5,并检测到原形药物。3d只检测到Cy4,7d检测不到代谢物。鱼肠道检测到6种代谢物,分别为Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6和Cy10,并检测到原形药物。7d可以检测到Cyl。脾消除最快,消除半衰期只有0.44d。心、肾脏和皮肤次之,消除半衰期在0.51-0.78d之间。以上组织消除半衰期比较接近,都没有超过1d。肝脏和肠中药物消除速度较慢,消除半衰期分别为1.14d和1.24d。总放射性检测结果显示,喹赛多及其代谢物在肠中残留量最高,持续时间最长,消除速度最慢,因此肠是残留靶组织。鱼肠道中,Cyl消除最慢,消除半衰期1.82d,与总残留相近,总体消除趋势相似,Cyl被确定为残留标示物。喹赛多在大鼠体内也广泛分布。给药后6h,肝脏、肾脏、膀胱、肾上腺和消化道中药物浓度高,脂肪最低(0.42mg/kg)。24h,大部分组织的药物浓度下降50%以上。3d,所有组织中的药物浓度均下降到0.5mg/kg以下。7d,大多数组织的浓度在0.1mg/kg以下,有些组织已不能测出。14d,只有肝脏和肾脏中有少量药物检出。6h,大鼠肝中检出6种代谢物,分别为Cy1、Cy4、Cy5、Cy6、Cy9和Cy11,但没有检出原形。7d只检测到Cy5。6h,大鼠肾脏检测到了6种代谢物,分别为Cy1、Cy2、Cy4、Cy5、Cy6和Cy9。7d只检测到Cy4。6h大鼠肌肉中检测到5种代谢物,分别为Cy1、Cy4、Cy5、Cy6和Cy9。3d检测到Cy4和Cy5。肌肉、脂肪和血液中药物消除最快,消除半衰期分别为1.0d、1.14d和1.26d。其次为小肠、大肠和肾上腺,消除速度相近,消除半衰期分别为1.61d、1.58d和1.44d。肝脏中药物消除速度较慢,消除半衰期为2.57d。肾脏中药物消除速度最慢,消除半衰期为4.33d。喹赛多及其代谢物在肾脏中残留量最高,持续时间见最长,消除速度最慢,因此肾脏是残留靶组织。大鼠肾脏中,Cy4消除最慢,消除半衰期2.04天,但是Cyl的消除半衰期与总残留最相近。最终确定,肾脏是猪、鸡和大鼠的残留靶组织,肠道是鱼的残留靶组织。Cyl是猪、鸡和鱼的残留标示物。Cy1、Cy4和Cy5可能是喹赛多药理和毒理作用的主要化合物。3喹赛多在动物体外肠道代谢研究根据肠道代谢的特点本课题建立了肠微粒体、肠黏膜、结肠内容物和回肠内容代谢系统。制备猪、鸡、鱼和大鼠肠微粒体和肠道黏膜,与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生系统进行孵育,采用细胞色素3A(CYP3A)的探针药物硝苯地平验证体系的活性,采用Brandford法测定蛋白浓度。结果表明,硝苯地平在肠微粒体和肠道黏膜中能够生成氧化的硝苯地平,表明肠黏膜和肠微粒体代谢酶活性良好,可以用于药物代谢研究。在厌氧条件下,制备结肠内容物和回肠内容物体外孵育液,通过对肠道细菌总厌氧菌、总需氧菌、大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸菌和脆弱拟杆菌进行计数,同时与探针酶底物p-硝基苯β-D-葡糖醛酸苷、p-硝基苯β-D-半乳糖苷和p-硝基苯β-D-半乳糖苷孵育验证体系的代谢活性。结果表明,细菌数量在0-48h内保持了良好的稳定性,酶活力稳定而且符合标注,可以用于代谢研究。在猪、鸡、鱼和大鼠肠微粒体NADPH再生系统中只发现了一种代谢物(Cy2),在猪、鸡和大鼠肠黏膜NADPH再生系统中只发现了脱二氧代谢产物(Cy1)和脱一氧代谢物(Cy2和Cy10),在鱼肠黏膜中发现了Cyl和Cy2。在猪、鸡和大鼠结肠内容物代谢体系中分别检测到了4种、4种和5种代谢产物,在鱼肠内容物中检测到了6种代谢物。猪和鸡中代谢物分别为Cy1、Cy2、Cy4和Cy5,大鼠中代谢物为Cy1、Cy2、Cy4、Cy5和Cy10,鱼中Cy1、Cy2、Cy9和Cy10。Cy1和Cy4是猪、鸡和大鼠结肠细菌代谢系统中的主要代谢产物,Cyl是鱼肠道细菌代谢系统中的主要代谢物。在回肠内容物代谢体系中,猪、鸡和大鼠分别检测到5种代谢物。猪回肠内容物中检测到Cy1、Cy2、CylO、Cy13和Cy16,鸡和大鼠回肠内容物中检测到相同的代谢产物。在动物的肠道肠黏膜代谢体系中,喹赛多主要发生了脱氧代谢。在肠道细菌代谢体系中,喹赛多主要发生了脱氧代谢,氢化反应,羟化反应,水解反应和侧链的断裂反应。羟化反应和水解反应只在小肠细菌中发生,氢化和断裂反应只在结肠体系中发生。在四种动物肠黏膜中,喹赛多代谢没有差异。在鸡回肠内容物中Cy2的比例最高,这可能与鸡肠道酸性有关系。在鱼肠道中发现了氢化代谢物,这可能与鱼类肠道细菌代谢有关。综合体内代谢和前期肝脏代谢发现,Cy4是在肠道细菌的作用下产生的。综上所述,本课题首次采用放射性示踪和LC/MS-IT-TOF技术研究喹赛多在猪、鸡、鱼和大鼠体内的代谢、分布和排泄,分离并鉴定了猪、鸡、鱼和大鼠体内的所有代谢产物,并对可食性组织中代谢物进行了定量,阐明了总残留和代谢在各个器官中的消除特征,确定了喹赛多的残留靶组织和残留标示物。本研究是喹赛多毒副作用机制研究、药理活性和毒性化合物研究的基础；对将来体内残留分析方法建立,最大残留限量和休药期的制定具有重要的指导意义。

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