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可溶性全长hPPARγ重组蛋白的制备及其活性研究
作 者: 夏铸
导 师: 余瑜
学 校: 重庆医科大学
专 业: 药物化学
关键词: hPPARγ 可溶性重组蛋白 全长 hPPARγ重组蛋白 制备 活性
分类号: R914
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
下 载: 26次
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内容摘要
PPARγ(peroxisome proliferator activatived receptor γ,过氧化物酶体增殖物激活受体)是核激素受体超家族中的非常重要成员之一,除在脂肪组织中高表达外,在肺、结肠、乳腺、卵巢等组织也有不同程度的高表达。PPARγ既可参与调控细胞内脂肪代谢和糖代谢,又可抑制肿瘤细胞增殖、分化以及促进细胞凋亡、转运等。因此,PPARγ是肿瘤细胞信号传导途径中的重要靶点蛋白,现已成为热点研究的核受体之一。外源性制备hPPARγ重组蛋白(Human Peroxisome proliferator-activated receptor γ),能够为其相关分子靶向药物的筛选打下坚实的基础。为此,本文拟制备可溶性全长hPPARγ重组蛋白,并对其活性进行研究,其主要研究内容及结果如下:1.采用带有六个组氨酸[His]6的泛素化小修饰蛋白(SUMO)为融合表达标签,设计并构建可溶性全长hPPARγ重组蛋白的表达质粒pReceiver-B13-SUMO-hPPARγ,经质粒转化,细菌培养,在优化条件(16℃、IPTG浓度0.5mM、诱导时间20h)下,表达出可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,与hPPARγ蛋白的理论分子量(67.2kDa,包括[His]6-SUMO)是一致的。2.采用Ni2+亲和色谱柱于变性条件下一步纯化目标蛋白,优化纯化条件,可获得纯度为90%的全长[His]6-SUMO-hPPARγ变性重组蛋白。变性目标蛋白经透析复性后,能获得可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。3.利用DEAE-52阴离子交换树脂在非变性条件下一步纯化目标蛋白,用NaCl溶液梯度洗脱目标蛋白,从每升LB培养介质中可获得135mg、纯度为80%的可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。4.采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(size exclusion chromato-graphy-high performance chromatography,SEC-HPLC),测定了全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白与Ros(Rosiglitazone,罗格列酮)配体结合活性,其Kd值为492nM,结合率约为70%。综上所述,本文建立以带有[His]6组氨酸的泛素化小修饰蛋白为融合表达标签的质粒、重组表达、纯化得到具有生物学活性的可溶性全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白的制备方法,采用DEAE-52阴离子交换树脂一步纯化法,从每升培养液中可制备得到135mg、纯度为80%的全长[His]6-SUMO-hPPARγ重组蛋白。为建立基于全长hPPARγ重组蛋白为作用靶点蛋白的抗肿瘤药物筛选平台奠定了基础。
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全文目录
英汉缩略语名词对照 5-7 符号说明 7-8 摘要 8-10 ABSTRACT 10-13 前言 13-16 第一部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白的表达 16-27 1 实验材料与仪器 16-20 2 方法与结果 20-25 3 讨论 25-26 4 小结 26-27 第二部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白的纯化 27-39 1 实验材料 28-30 2 方法与结果 30-36 3 讨论 36-38 4 小结 38-39 第三部分 可溶性全长 hPPARγ重组蛋白体外活性研究 39-50 1 实验材料 40-41 2 方法与结果 41-48 3 讨论 48-49 4 小结 49-50 全文总结 50-51 参考文献 51-54 文献综述 54-62 参考文献 59-62 致谢 62-63 攻读硕士学位期间发表的论文 63-64
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学
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