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MAD2B与TCF4的相互作用及其对毛乳头细胞的作用

作　者: 张可洲
导　师: 杨希川
学　校: 第三军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 毛乳头细胞 T细胞因子4 MAD2B Wnt 细胞因子
分类号: R758.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

一．研究背景和目的毛囊是皮肤的附属器官，是毛发生长的主体，作为人体唯一可以完全循环再生的器官，毛囊的研究具有重要的生物学意义；而且毛囊相关的疾病直接影响患者的外部形象，使患者承受了很大的心理压力，影响身心健康。因此毛囊的研究日益受到重视。毛乳头(dermal papilla，DP)位于毛囊的基底部，在毛囊的形态发育以及周期性再生调控中起到关键作用，而且在体外培养中可以诱导毛囊的重建。毛乳头细胞(dermalpapilla cells，DPC)是构成DP的唯一细胞，不仅在胚胎期诱导上皮细胞形成毛囊，而且在出生后调控成熟毛囊的周期性再生。这种调控可通过自分泌、旁分泌等方式作用于DPC自身和周边细胞，机制涉及多种信号通路和调节因子，比较重要的有Wnt蛋白、Notch蛋白、骨形成蛋白(BMP)、纤维生长因子(FGF)、血管内皮因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)等多种蛋白及细胞因子。因此，DPC是目前毛囊相关研究的热点细胞之一。DPC的重要生物学特征是凝集性生长，这种特性和DP的功能状态相关，其凝集性生长和体外诱导毛囊重建的机制尚不清楚，各种信号通路对DPC的调节作用仍需要进一步研究。现研究证实，Wnt通路在毛发发育和周期调控中发挥着重要的作用，对维持DPC的凝集生长能力有着关键的作用。我科前期实验证实，Wnt信号通路的重要调节因子T细胞生长因子4(T cell factor，TCF4)在凝集生长的DPC特异表达，增强TCF4的表达对体外培养的DPC有明显促进作用，并可以促进DPC中SCF、HGF等外分泌因子的表达，通过自分泌和旁分泌机制调控毛囊的发育。MAD2B(mitotic arrest deficient2-like2，又称MAD2L2)蛋白是通过酵母双杂交发现的可与TCF4结合的蛋白，在有丝分裂的周期调节中发挥着重要的作用。本课题拟研究在凝集状态下生长的DPC中是否存在MAD2B蛋白和TCF4的相互作用，以及其是否对TCF4调控的Wnt信号通路活性和下游细胞因子的表达存在调控作用，是否影响DPC的生物学功能。二、实验方法和结果1、从人头皮毛囊中分离培养DPC，观察原代及其传代的DPC生长特性，提取其总的RNA，以供后续试验。2、利用免疫共沉淀技术测定在DPC中MAD2B蛋白和TCF4蛋白存在相互作用。3、构建pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4质粒，经酶切鉴定后使用LipofectamineTM2000脂质体转染法转染至DPC，使用倒置荧光显微镜、Western blot明确其在DPC内存在过表达，质粒构建和转染成功。4、设置试验分组：pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4质粒共转染组，pIRES2-TCF4转染组，正常DPC对照组。结果证实，与单独转染pIRES2-TCF4组相比，共转染pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4后Wnt/β-catenin信号有明显的降低(p＜0.05)，而siMAD2B和pIRES2-TCF4共转染后则能纠正这种降低。pIRES2-TCF4转染组和siMAD2B、pIRES2-TCF4共转染组的Wnt/β-catenin信号都比对照组有明显的升高(p＜0.05)。使用CCK-8测定对细胞增殖活性的影响，pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共转染组的D450平均值为0.49±0.18，pIRES2-TCF4转染组D450平均值为0.79±0.15，正常DP对照组D450平均值为0.57±0.15。其中pIRES2-TCF4转染组与pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共转染组和正常DP对照组有明显差异(p＜0.05)；pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共转染组与正常DP组未见明显差异。5、通过荧光定量PCR技术发现，在MAD2B过表达的DPC，其分泌的细胞因子IGF-1、VEGF和HGF的mRNA的表达，相对于正常对照组有明显减少。三、结论1、免疫共沉淀进一步证实MAD2B与TCF4在DPC中存在相互作用。2、MAD2B过表达可能通过Wnt信号通路途径抑制DPC的增殖。3、过表达MAD2B可抑制DPC旁分泌因子IGF-1、VEGF、HGF的合成。通过以上实验，为进一步了解DPC生物学功能，特别是Wnt途径在DPC中的调控机制奠定了基础。

MAD2B与TCF4的相互作用及其对毛乳头细胞的作用

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