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TNF-α对牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化及骨创伤修复影响的研究

作　者: 黄海云
导　师: 杨丕山; 徐欣
学　校: 山东大学
专　业: 口腔内科学
关键词: TNF-α 牙周膜干细胞骨髓间充质干细胞成骨基因 NF-κB通路
分类号: R780.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景和目的干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,它包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于伦理学问题在临床上的应用受到限制.成体干细胞通常以极少量的数量存在于局限的区域。从不同组织中分离成体干细胞目前尚无统一、理想的方法,主要是根据干细胞具有克隆形成能力的普遍特点和不同干细胞所特有的生物、物理学特性进行分离和鉴定的。采用Stro-1抗体免疫磁珠分离或Stro-1抗体通过流式细胞分选是目前较为公认的有效分离方法。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓基质中的干细胞,是目前研究最充分、应用最广泛的干细胞。已有研究表明,牙周膜中存在着干细胞,表达间充质干细胞的标记物Stro-1,并具有多向分化潜能,称为牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cells, PDLSCs),可作为牙周再生的种子细胞。干细胞在临床治疗中的应用越来越广泛,研究表明,其增殖与分化是影响治疗效果的关键因素。干细胞的增殖和分化受多种内在机制和微环境因素的影响。微环境是影响干细胞移植治疗效果、影响组织再生的重要因素。在组织再生的过程中经常会遇到因遭到严重破坏而发生炎性反应的过程。干细胞处于炎性微环境中,其增殖和分化的调控很可能受到炎性因子的影响。炎性微环境中的炎性分子包括内源性的炎性介质(TNF-α, IL-1β, PGE2等)以及外源性分子(细菌脂多糖lipopolysaccharide, LPS,磨损颗粒particulate debris,机械张力或剪切力等)。其中TNF-α是目前公认的最重要的一个内源性诱生型促炎细胞因子,也是内毒素引起的感染性疾病最直接最关键的炎症介质。TNF-α通过激活靶细胞内MAPKS与NF-κB通路使细胞发生增殖、分化、炎症等应激反应。NF-κB是一种广泛存在于体内细胞的核转录因子,调节细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体基因的表达,影响机体内的细胞分化、免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤生长等多种生物学功能。现有研究结果显示炎性因子能够影响成骨细胞特异性基因的表达、细胞外基质的分泌以及成骨细胞的凋亡。然而,这些研究大都以鼠成骨细胞系为研究对象,并没有说明干细胞向成骨细胞分化的过程中炎性信号通路的作用。因此,在组织再生过程中,慢性、长期、高浓度的炎性微环境对于成体干细胞增殖和分化的影响亟需深入的研究。本研究采用免疫磁珠法分离PDLSCs和BMSCs,以不同浓度TNF-α刺激PDLSCs和BMSCs,探讨TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化的影响；并对这种影响的信号通路进行了初步探讨；同时进行体内实验,观察在BMSCs中阻断NF-κB通路对于骨创伤愈合的影响,以期更好地了解炎症刺激条件下成体干细胞的生物学特性以及基于成体干细胞的创伤修复过程,为临床研发新的更有效的牙周治疗方法开辟一条新思路。材料和方法1. TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化影响的研究组织块法分离培养人原代牙周膜细胞,复苏-80℃冻存的ST2细胞,传代培养,细胞生长状态良好后用生物素标记的Stro-1抗体,免疫磁珠正选法分离PDLSCs和ST2细胞中BMSCs,免疫细胞化学染色和矿化诱导初步鉴定其干细胞特性；MTT法检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs增殖的影响；PNPP法检测矿化诱导条件下不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs碱性磷酸酶活力的影响；实时定量PCR检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs成骨分化基因OSX, RUNX2, ALP, OC mRNA的影响；矿化结节茜素红染色法检测不同浓度TNF-α对PDLSCs和BMSCs矿化的影响。2. TNF-α对BMSCs增殖和成骨分化影响的信号通路研究用脂质体法将IκBα-mut转入逆转录病毒包装细胞PT67,嘌呤霉素筛选获得稳定的产毒细胞株；然后用含IκBα-mut病毒的培养液感染BMSCs,嘌呤霉素筛选获得稳定超表达IκBα-mut的BMSCs; MTT法检测不同浓度TNF-α对稳定超表达IκBα-mut的BMSCs增殖的影响；PNPP法检测矿化诱导条件下不同浓度TNF-α对稳定超表达IκBα-mut的BMSCs碱性磷酸酶活力的影响；实时定量PCR检测不同浓度TNF-α对稳定超表达IκBα-mut的BMSCs成骨分化基因OSX, RUNX2,ALP, OC mRNA的影响；矿化结节茜素红染色法检测不同浓度TNF-α对稳定超表达ⅠκBa-mut的BMSCs矿化的影响。3. TNF-α对小鼠骨创伤修复影响的研究采用全血贴壁法分离、培养小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs),并用前述方法将细胞稳定转染pBabe-puro-IκBα-mut,获得稳定超表达IκBa-mut的BMSCs;制备小鼠颅骨缺损模型,进行动物实验,分组如下：BALB/c小鼠15只,体重18-20g,共分为3组,每组5只。A组颅骨缺损,缺损区植入BMSCs,腹腔注射PBSB组颅骨缺损,缺损区植入BMSCs,隔日腹腔注射TNF-α5ug/kgC组颅骨缺损,缺损区植入稳定超表达IκBa-mut的BMSCs,隔日腹腔注射TNF-a5ug/kg两周后取颅骨标本,进行大体观察,HE染色,计算各组新骨生成面积并进行统计学分析。结果1.TNF-α对PDLSCs和BMSCs曾殖和成骨分化的影响(1)分离得到的牙周膜干细胞约为0.1%,经SP免疫细胞化学检测,牙周膜干细胞抗波形丝蛋白(Vimentin)染色阳性,抗角蛋白染色阴性,抗Stro-1染色阳性,具有间充质干细胞的特征。矿化液连续培养21d, Vonkossa染色可见染成棕褐色的矿化结节。分离得到的Stro-1+BMSCs细胞比例约为30%,14d行茜素红染色可见染成鲜红色的矿化结节。(2)MTT结果显示：与对照组相比,不同浓度的TNFa(0.01-100ng/ml)对PDLSCs和BMSCs增殖的影响没有统计学意义(p<0.05)。(3)与对照组(Ong/mlTNF-a)相比,加入含TNF-α的矿化诱导液48hr后,PDLSCs和BMSCs碱性磷酸酶活力(ALP activity)在低浓度时(0.01,0.1ng/ml)增加,在高浓度(10,100ng/ml)时下降,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)与对照组(Ong/mlTNF-a)相比,加入含TNF-α的矿化诱导液48hr后,PDLSCs和BMSCs成骨分化基因(RUNX2、OSX、ALP和OC) mRNA在低浓度时(0.01,0.1ng/ml)增加,在高浓度(10,100ng/ml)时下降,差异有统计学意义(p<0.05)。(5)与对照组(Ong/mlTNF-α)相比,加入含TNF-α(0.1,1,100ng/ml)的矿化诱导液4周后,PDLSCs和BMSCs所形成的矿化结节量明显减少(p<0.05)。2.TNF一α对BMSCs增殖和成骨分化影响的信号通路(1) BMSCs稳定转染pBabe-puro—IκBα-mut后,NF-κB通路被成功阻断,Weston blot显示：胞浆内IκBα蛋白质的含量增加,胞核内p65蛋白质含量比转染空载体组减少。(2)NF-κB通路被阻断后,TNF-α呈浓度依赖性抑制BMSCs的增殖。(3)NF-κB通路被阻断后,可以逆转高浓度TNF-α(10,100ng/ml)对BMSCs碱性磷酸酶活力的影响,而对低浓度TNF-α(0.01,0.1ng/ml)对BMSCs碱性磷酸酶活力的影响没有作用。(4)NF-κB通路被阻断后,可以逆转高浓度TNF-α(10,100ng/ml)对BMSCs成骨分化基因的影响,而对低浓度TNF-α(0.01,0.1ng/ml)对BMSCs成骨分化基因的影响没有作用。(5)NF-κB通路被阻断后,可以逆转长时间(4周)高浓度TNF-α(10ng/ml)对BMSCs矿化的影响。3.TNF-α对小鼠骨创伤修复影响的研究体内实验结果显示：正常情况下,植入同种异体BMSCs,可以促进颅骨缺损的修复；但在TNF-α刺激下,再植入同种异体BMSCs,小鼠颅骨缺损的修复能力比正常情况下明显降低,新骨生成面积明显减少。相反地,植入了NF-κB通路被阻断的同种异体BMSCs后,骨的再生能力明显增强,可以达到和正常情况下的新骨生成面积。结果表明：NF-κB通路被阻断后,可以逆转长期高浓度TNF-α对骨缺损修复的抑制作用。结论(1)采用免疫磁珠法成功分离培养了PDLSCs和BMSCs,并进行了初步鉴定,干细胞免疫磁珠分离法简便易行,值得推广。(2)不同浓度不同时间TNF-α对干细胞成骨分化的影响不同,长时间高浓度抑制干细胞的成骨分化,短时间低浓度的TNF-α对干细胞成骨分化有增强作用。(3)NF-κB通路被阻断后,可以逆转高浓度TNF-α对干细胞成骨分化的作用,提示长时间高浓度TNF-α抑制干细胞的成骨分化是通过NF-κB信号通路。(4)高浓度TNF-α长期刺激影响干细胞在骨缺损中的修复功能,阻断NF-κB通路逆转长期高浓度TNF-α对骨缺损修复的抑制作用,提高修复效果。(5)不同浓度TNF-α对干细胞的增殖影响不同,是多条信号通路相互作用的结果。

全文目录

中文摘要  6-11
ABSTRACT  11-18
符号说明  18-20
前言  20-24
第一部分 TNF-α对牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化影响的研究  24-50
  材料和方法  26-36
  结果  36-46
  讨论  46-50
第二部分 TNF-α对牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化影响的信号通路研究  50-70
  材料和方法  51-60
  结果  60-66
  讨论  66-70
第三部分 TNF-α对小鼠骨创伤修复影响的研究  70-79
  材料和方法  71-74
  结果  74-77
  讨论  77-79
全文总结  79-80
参考文献  80-85
致谢  85-87
攻读博士学位期间发表论文统计  87-88
攻读博士学位期间发表或待发表论文  88-105
  Role of bone sialopretein (BSP)in osteoclast-mediatedosteolytic metastasis  88-97
  Dose-speciifc effects of tumor necrosis factor alpha on osteogenic differentiationof mesenchymal stem cells  97-105
学位论文评阅及答辩情况表  105

TNF-α对牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化及骨创伤修复影响的研究

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