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结缔组织生长因子在视网膜色素上皮细胞中的作用机制研究

作　者: 于颖
导　师: 陈有信
学　校: 北京协和医学院
专　业: 眼科学
关键词: 增殖性玻璃体视网膜病变 结缔组织生长因子 RNA干扰
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的本研究欲通过研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell, RPE)细胞的刺激作用来探讨增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy, PVR)的发生机制。方法1.培养ARPE-19细胞,使用Western Blot检测CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响。2.构建p3xFLAG-CMV14/CTGF真核表达载体,设计及合成三对针对CTGF的siRNA,通过Western Blot筛选有效靶点,合成有效靶点的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与线性化的pGC-LV-GFP载体连接,通过PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序鉴定；将重组CTGF shRNA (?)的质粒与病毒包装的辅助质粒共转染293T细胞,将包装产生的慢病毒感染ARPE-19细胞,W(?)estern Blot检测CTGF的表达。3.观察TGF-β2对ARPE-19产生CTGF、FN以及α-SMA的表达的影响作用,以及靶向抑制CTGF后,ARPE-19产生CTGF、FN以及MMP-2以及α-SMA的表达受到干扰的情况4.细胞刮伤实验测定CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响以及靶向抑制CTGF后对于ARPE-19细胞迁移能力的影响结果1. CTGF可以明显刺激ARPE-19细胞的增殖。2.通过双酶切和基因测序证实靶向CTGF的RNA慢病毒载体构建成功,WesternBlot证实经慢病毒感染后的ARPE-19细胞中的CTGF的蛋白水平明显减低。3.TGF-β2刺激了ARPE-19产生CTGF、FN以及α-SMA,而靶向抑制CTGF后,ARPE-19产生CTGF、FN以及MMP-2以及α-SMA的表达受到干扰。4.在细胞刮伤实验中,加入了siCTGF的细胞的迁移能力明显下降。结论CTGF可以明显刺激ARPE-19细胞的增殖并随着时间的增加细胞数亦增加,加入siCTGF后可以明显抑制ARPE-19细胞的增殖,细胞数量下降

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
缩略词表  8-9
第3章 引言  9-11
  3.1 选题的背景及意义  9-10
  3.2 本文的研究内容和主要贡献  10-11
第4章 CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响  11-18
  4.1 本章引论  11
  4.2 材料和方法  11-15
    4.2.1 主要试剂  11-12
    4.2.2 主要仪器  12-13
    4.2.3 ARPE-19细胞培养及冻存、复苏  13-15
  4.3 实验结果  15-16
    4.3.1 CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响  15-16
    4.3.2 CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响  16
  4.4 讨论  16-17
    4.4.1 MTT法和CCK-8法检测悬浮细胞增殖的比较  16
    4.4.2 CTGF对ARPE-19细胞的研究展望  16-17
  参考文献  17-18
第5章 靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖、迁移及EMT的影响  18-42
  5.1 本章引论  18
  5.2 材料和方法  18-35
    5.2.1 主要试剂、缓冲液及溶液配制  18
    5.2.2 主要仪器：见前  18
    5.2.3 GCI92893/SMAD4RNAi慢病毒载体构建  18-25
    5.2.4 慢病毒包装  25-34
    5.2.5 ARPE-19细胞的感染  34
    5.2.6 Western Blot检测慢病毒感染后ARPE-19细胞中CTGF的表达  34-35
    5.2.7 CCK-8法测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响  35
    5.2.8 细胞刮伤实验(Wound healing)测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响  35
  5.3 结果  35-39
    5.3.1 p3xFLAG-CMV14/CTGF克隆构建成功  35-37
    5.3.2 Western Blot检测CTGF RNAi靶点有效性  37
    5.3.3 绿色荧光蛋白检测ARPE-19细胞的感染情况  37-38
    5.3.4 Western Blot检测ARPE-19细胞对TGF-β2的反应  38
    5.3.5 靶向抑制CTGF后,Western Blot检测ARPE-19细胞对TGF-β2的反应  38
    5.3.6 CCK-8法测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响  38-39
    5.3.7 细胞刮伤实验(Wound healing)测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响  39
  5.4 讨论  39-41
  参考文献  41-42
第6章 综述 结缔组织生长因子研究进展  42-64
  6.1 增殖性玻璃体视网膜病变相关进展回顾  42-47
    6.1.1 PVR形成中主要的细胞因子  42-44
    6.1.2 PVR的研究最新进展  44-47
  6.2 CTGF蛋白结构和生物学特性  47-51
    6.2.1 CTGF的蛋白结构  47-48
    6.2.2 CTGF的生物学特性  48-51
  6.3 CTGF表达调控及信号传导通路  51-56
    6.3.1 上调CTGF表达的因素  51-54
    6.3.2 抑制CTGF表达的因素  54
    6.3.3 CTGF对于眼部增殖性疾病的影响  54-55
    6.3.4 SiRNA的眼部应用  55-56
  参考文献  56-64
第7章 结论  64-66
  7.1 结论  64
  7.2 展望  64-66
致谢  66-67
个人简历  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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