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CoCl_2诱导大鼠视网膜前体细胞表达VEGF164和SEMA3A的初步研究

作　者: 梁安然
导　师: 赖铭莹
学　校: 暨南大学
专　业: 眼科学
关键词: 缺氧视网膜前体细胞血管内皮生长因子轴突坍塌导向因子 CoCl2
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：观察氯化钴（CoCl₂）模拟缺氧环境下对大鼠视网膜前体细胞（RPCs）中血管内皮生长因子164（VEGF164）、轴突坍塌导向因子（SEMA3A）表达的影响，探讨RPCs中二者在缺氧条件下相互作用关系及意义。方法:全神经球贴壁法分离、培养RPCs。免疫组化法鉴定RPCs，检测VEGF164、SEMA3A及二者共同受体NRP-1的表达。应用CCK8法检测不同浓度CoCl₂（0、50、100、150、200μmol/L）干预24小时（h）以及检测150μmol/L CoCl₂作用不同时间（0、12、24、36、48、72h）后RPCs活性的变化，应用RealTime PCR及ELISA，检测上述各组RPCs VEGF164及SEMA3AmRNA及蛋白的表达。结果:全神经球贴壁法培养的RPCs高表达神经干细胞特异性标记（Nestin），较高表达VEGF164、SEMA3A、NRP-1，自然分化后表达视网膜细胞标志性抗原Rhodopsine、 MAP-2和GFAP。CoCl₂在一定浓度（0²00μmol/L）及作用时间范围（0⁴8h）内，RPCs活性不受损伤，缺氧培养时间相同时，随着CoCl₂浓度的增加VEGF mRNA的表达逐渐增加而后降低，SEMA3A的表达降低后逐渐增加。当CoCl₂浓度为150μmol/L培养不同时间时，随着缺氧干预时间的延长，VEGF mRNA的表达亦是逐渐增加而后降低,SEMA3A的表达降低后逐渐增加。蛋白与基因表达的变化基本一致。结论:全神经球贴壁法培养RPCs能较好的表达干细胞特性。体外培养的正常RPCs表达VEGF164、SEMA3A、NRP-1。一定浓度及作用一定时间的CoCl₂对RPCs活性损伤不明显。CoCl₂模拟缺氧环境下，缺氧使RPCs VEGF164和SEMA3A的分泌具有时间和剂量依赖性，可能在缺氧一定程度后通过上调SEMA3A来降低VEGF164的表达,这可能成为对抗新生血管性视网膜病变的保护机制之一。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-7
前言  7-9
第一部分视网膜前体细胞的分离、培养和鉴定  9-22
  1 材料与方法  9-14
    1.1 材料  9-12
    1.2 方法  12-14
  2 结果  14-19
    2.1 RPCs 的形态学观察  14-15
    2.2 RPCs 的流式细胞学鉴定  15
    2.3 RPCs 的免疫组化鉴定  15-19
  3 讨论  19-20
  4 小结  20
  5 参考文献  20-22
第二部分 CoCl_2诱导视网膜前体细胞表达 VEGF164 和 SEMA3A 的研究  22-48
  1 材料与方法  22-29
    1.1 材料  22-24
    1.2 方法  24-29
  2 结果  29-39
    2.1 CCK8 法测定各组 RPCs 活性  29-30
    2.2 Real-Time PCR 检测 RPCs VEGF164 及 SEMA3A mRNA 的表达  30-35
    2.3 ELISA 检测 VEGF164、SEMA3A 蛋白的表达  35-39
  3 讨论  39-44
    3.1 缺血缺氧性视网膜病变的发病机制  39
    3.2 CoCl_2体外诱导缺氧的机制  39-40
    3.3 CCK8（Cell Counting Kit）法检测细胞活性的原理和意义  40
    3.4 CCK8 法检测 CoCl_2处理后 RPCs 活性  40
    3.5 Real Time-PCR 原理  40-41
    3.6 ELISA 原理  41
    3.7 VEGF 与新生血管的发生  41-42
    3.8 SEMA3A 与 VEGF 具有共同受体 NRP-136  42
    3.9 CoCl_2模拟缺氧坏境下 VEGF 和 SEMA3A 在大鼠 RPCs 中的表达  42-44
  4 小结  44
  5 参考文献  44-48
全文总结  48-49
在学期间发表论文清单  49-50
致谢  50

CoCl_2诱导大鼠视网膜前体细胞表达VEGF164和SEMA3A的初步研究

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