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Egr-hTERTC27联合5-FU治疗鼻咽癌及TCF3抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究

作　者: 林桂渺
导　师: 杨宝学
学　校: 吉林大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: Egr-1 5-FU hTERTC27 鼻咽癌 TCF3 胚胎癌 Oct4
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

1Egr-hTERTC27联合5-FU治疗鼻咽癌的实验研究研究背景鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是一种发生于鼻咽部粘膜的恶性肿瘤。多发区主要在中国的广东、广西、福建等地。发病年龄范围较广，主要为中年人，也有青少年患病者。鼻咽癌恶性程度很高，常常伴有局部淋巴结转移或远处转移。发病因素较为复杂，包括遗传因素、EB病毒因素和环境致癌因素。目前鼻咽癌的治疗主要以局部放射治疗和化学疗法为主。但是，对于晚期鼻咽癌和早期切除但预后不良的鼻咽癌患者，目前仍然没有有效的治疗方式。因此，寻找一种新的治疗方式迫在眉睫。5-氟尿嘧啶（5-Fluroracil，5-FU）是一种常用的治疗鼻咽癌的化疗药物，它是尿嘧啶5位上的氢被氟取代的一种衍生物，能够抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，干扰DNA和蛋白质的合成。然而，5-FU毒性作用较大，患者常常因为耐受不了高剂量5-FU引起的不良反应而被迫终止治疗。因此，寻求新型的生物治疗方式来联合杀伤肿瘤细胞，协同减低化疗药物的使用剂量，提高患者的耐受能力，增强肿瘤化疗的治疗效果是目前急需解决的问题之一。早期生长反应基因1(early growth response gene，Egr-1)启动子中有6个CArG[CC(A+T-rich)6GG]血清反应元件，在电离辐射或化学药物的诱导下可以被激活，从而启动下游基因的表达，这种作用是通过ROIs（reactive oxygen intermediates，ROIS）介导的。科学家利用Egr-1启动子作为桥梁，提出了肿瘤的基因-化学治疗设想。将同时具有诱导特性的Egr-1启动子和肿瘤杀伤基因或是免疫治疗基因转入体内，在对肿瘤进行化疗的同时诱导目的基因的高表达，从而达到化学治疗和基因治疗的双重肿瘤杀伤作用，降低等效化疗药物的治疗剂量，缓解正常组织的损伤，降低毒副作用，提高治疗效果。利用Egr-1启动子的桥梁作用，联合治疗基因如CD、TK、CDglyTK、endostatin等治疗胃肠道癌、脑神经胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤已取得了令人瞩目的成绩。端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的一个催化亚单位，对于保持端粒长度和延长细胞寿命具有重要作用。端粒酶逆转录酶在大多数肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中几乎很少表达。因此，端粒酶逆转录酶可作为比较理想的肿瘤检测诊断的标志和肿瘤基因治疗的靶点。hTERTC27，是人端粒酶逆转录酶C-末端一个27kDa的多肽，该片段保留了端粒酶RNA结合域而去除了逆转录结构域，2002年香港大学Huang JJ与Lin MC教授利用基因重组技术构建了hTERTC27多肽片段。体外实验研究证实在人宫颈癌HeLa细胞中过表达hTERTC27可以引起端粒的功能异常，促使染色体末端快速融合，并且增强细胞对过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激反应。此外，hTERTC27过表达可以诱导HeLa细胞出现凋亡和老化，对于接种HeLa细胞的宫颈癌裸鼠模型也具有明显的抑瘤效果。除了HeLa之外，进一步研究表明腺病毒载体装载的hTERTC27多肽片段对于接种U87-MG人脑胶质细胞瘤的裸鼠模型也产生了同样明显的抑瘤效果。因此，hTERTC27做为新型构建的抗肿瘤多肽，具有良好的应用前景。但是，hTERTC27是否对人鼻咽癌C666具有抗肿瘤效应，目前国内外尚未见相关研究报道。本研究以Egr-1启动子作为桥梁，将hTERTC27片段构建在Egr-1启动子下游，通过5-FU诱导hTERTC27高表达。观察5-FU诱导Egr-1启动子驱动的hTERTC27（简称Egr-hTERTC27）联合5-FU对鼻咽癌的体内外抑瘤效应，并初步探讨其作用机制。本研究首次以Egr-1启动子作为桥梁，以5-FU作为诱导剂，将hTERTC27片段联合5-FU对鼻咽癌进行基因-化疗双重治疗，为鼻咽癌肿瘤治疗提供一种新的治疗方案。方法采用脂质体转染法建立稳定细胞株，采用荧光显微镜、流式细胞术和Western blot方法观察5-FU对Egr-1启动子的诱导效应。采用MTT法、细胞克隆形成实验、AnnexinV/PI双染法结合流式细胞术，以及Tunel技术观察Egr-hTERTC27联合5-FU对鼻咽癌C666-1细胞的体外协同抑瘤效应。采用稳定细胞株建立鼻咽癌皮下移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线、瘤重和HE染色观察二者体内协同抑瘤效应。采用Western blot分析观察凋亡激活相关蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9的表达以及Bcl-2抑凋亡蛋白的表达。结果体外实验结果表明，5-FU可以成功诱导Egr-1启动子下游目的基因hTERTC27的高表达，5-FU诱导后的hTERTC27蛋白表达较对照组最多可增加7倍左右。过表达的hTERTC27能够提高鼻咽癌C666-1细胞对5-FU的敏感性，并且进一步抑制细胞增殖达20%。Egr-hTERTC27(Egr-1启动子诱导过表达的hTERTC27)联合5-FU可以协同抑制细胞增殖以及促进细胞凋亡，联合治疗组的细胞凋亡率是hTERTC27单独治疗组的4.8倍，是5-FU单独治疗组的1.8倍。体内实验结果表明，Egr-hTERTC27联合5-FU协同地抑制肿瘤生长速度、肿瘤重量，并且降低肿瘤的局部浸润。此外，联合治疗组凋亡激活相关蛋白如剪切的PARP、caspase-3、 caspase-9蛋白表达增加，抑凋亡Bcl-2蛋白表达减少。结论Egr-1启动子介导的hTERTC27过表达(Egr-hTERTC27)联合化疗药物5-FU能够协同抑制鼻咽癌的生长并促进其凋亡，对鼻咽癌具有很好的治疗效果。这些结果提示我们，Egr-hTERTC27联合5-FU可能作为鼻咽癌治疗的一种新途径。2TCF3抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究研究背景胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）来源于囊胚发育的内层细胞团（InnerCell Mass），是一种高度未分化的干细胞。ES细胞可以自我更新、无限增殖并且具有多分化潜能，能够分化成体内所有组织和器官。ES细胞的发现为生物发育调控的研究以及组织生物学工程的研究带来深远的影响。但是由于ES细胞研究受到伦理和道德的约束，很大程度上限制ES细胞的研究。胚胎癌(Embryonic carcinoma，EC)细胞是一种高度恶性的肿瘤细胞，是一种来源于恶性畸胎瘤的干细胞。它既属于一种肿瘤干细胞，又与ES细胞类似，具有相近的组织学起源以及生物学特性。由于EC细胞与肿瘤干细胞以及ES细胞之间存在许多相似性，EC细胞越来越受到广大干细胞研究者的青睐。ES细胞的调控机制错综复杂，其具体机制尚不清楚晰，进一步探索EC细胞的调控机制，对于正确理解EC及ES细胞的发育生物学特性及其应用具有重要的意义。Wnt信号通路途径在ES细胞中扮演重要角色，它可以调节多种ES细胞的自我更新能力和分化潜能。它能够调节Oct-3/4、Nanog等重要干性基因的表达，调节ES细胞在皮肤、神经系统、血液系统的命运决定。此外，Wnt能够上调BMP家族蛋白的表达，抑制ES细胞向神经的分化等。T细胞因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族蛋白是Wnt家族蛋白最终的效应分子，它具有一个保守的HMG结构域和与β-连环蛋白（β-catenin）相互作用的结构域。Wnt信号途径的活化促使β-连环蛋白在细胞质中积累，并且进入细胞核，与TCF/LEF家族蛋白相互作用，进一步调节靶基因如c-Myc、Cyclin D1等的表达。TCF/LEF是一类具有双向调节功能的转录因子。一方面，它可以和CtBP以及Groucho蛋白结合从而抑制基因转录。另一方面，它可以结合β-catenin从而促进基因转录。TCF家族蛋白有四种，包括TCF1-4，其中TCF3在ES细胞中表达含量最高。最近研究表明TCF3在ES细胞中可以和TLE2形成抑制复合物，共定位在干性基因Oct4，Nanog的启动子上，是Oct4和Nanog核心调节网络中非常重要的组成部分。TCF3的缺失可以增加Oct4和Nanog等其他ES转录因子的表达，并且使ES细胞具有抵抗分化的潜能。正常情况下，体外培养的小鼠ES细胞需要在外源性白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF)的作用下才能保持自我更新的能力，将TCF3去除可以使小鼠ES细胞在没有LIF的条件下也可以进行自我更新，并且在分化刺激条件下出现分化迟缓。多项研究表明TCF3在维持ES细胞的增殖和自我更新能力中意义重要，但是其在EC细胞中的作用以及具体机制尚不明确。本研究目的在于观察TCF3在EC肿瘤发生和发展的作用并初步探讨其作用机制。本研究首次探讨TCF3在EC中的作用，为进一步理解干细胞和EC的调控机制提供了一定的理论依据。方法采用分子克隆技术构建逆转录病毒重组载体，利用逆转录病毒包装感染技术建立TCF3稳定过表达的F9胚胎癌细胞株。Western blot和RT-PCR分析鉴定稳定细胞株的建立。应用TCF3过表达的F9胚胎癌细胞株进行体外研究，细胞计数法、MTT比色法以及软琼脂克隆形成实验观察TCF3过表达对F9细胞增殖能力的影响。细胞迁移实验观察TCF3过表达对F9细胞迁移能力的影响。采用稳定细胞株建立小鼠胚胎癌皮下移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线、瘤重、生存率以及HE染色观察TCF3过表达对胚胎癌生长的影响。采用细胞免疫荧光和Western blot法观察Oct4在F9细胞中的表达。采用RT-PCR和Western blot分析法观察TCF3过表达对Oct4基因mRNA转录和蛋白表达的影响。采用RNAi技术观察TCF3干涉沉默后对Oct4表达的影响。结果体外实验结果表明TCF3过表达显著抑制F9细胞株的增殖、克隆形成和迁移能力，抑制率分别达到约30%、45%和30%。体内小鼠移植瘤模型结果表明TCF3过表达显著抑制肿瘤体积大小(36.4%)、肿瘤重量(34.8%)、肿瘤恶性程度进程和肿瘤局部浸润，以及延长了荷瘤小鼠的生存时间。F9胚胎癌中TCF3的过表达能够下调Oct4蛋白的表达。相反，siRNA干涉TCF3的表达能够上调Oct4的表达。结论TCF3过表达能够抑制小鼠F9胚胎癌的生长，其机制可能是因为下调Oct4蛋白的表达。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。

全文目录

中文摘要  5-10
Abstract  10-15
英文缩写词表  15-19
第1章 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 治疗鼻咽癌的实验研究  19-77
  前言  19-21
  中文摘要  21-22
  Abstract  22-23
  第1节文献综述  23-37
    1.1 Egr-1 启动子在肿瘤基因治疗研究进展  23-27
    1.2 端粒酶与肿瘤治疗的研究进展  27-31
    1.3 hTERTC27 与肿瘤治疗研究进展  31-37
  第2节材料与方法  37-47
    2.1 实验材料  37
    2.2 实验方法  37-47
  第3节结果  47-59
    3.1 5-FU 对 pEgr-hTERTC27-GFP 的诱导效应  47-49
    3.2 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌 C666-1 的体外抑瘤实验  49-55
    3.3 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌的体内抑瘤实验  55-59
  第4节讨论  59-65
    4.1 pEgr-hTERTC27-GFP 重组质粒的化学诱导表达特性  60-61
    4.2 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对人鼻咽癌 C666-1 细胞的生长抑制作用及可能机制  61-62
    4.3 Egr-hTERTC27 联合 5-FU 对鼻咽癌小鼠移植瘤生长的影响及可能机制  62-65
  第5节结论  65-66
  参考文献  66-77
第2章 TCF3 抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究  77-131
  前言  77-78
  中文摘要  78-79
  Abstract  79-80
  第1节文献综述  80-93
    1.1 诱导多潜能干细胞 iPS 研究进展  80-84
    1.2 Wnt 信号通路与肿瘤关系研究进展  84-89
    1.3 TCF3 的研究进展  89-93
  第2节材料和方法  93-103
    2.1 实验材料  93
    2.2 实验方法  93-103
  第3节结果  103-116
    3.1 TCF3 逆转录病毒载体构建以及稳定细胞株的建立  103-105
    3.2 TCF3 过表达抑制小鼠 F9 胚胎癌细胞的体外研究  105-108
    3.3 TCF3 过表达抑制小鼠胚胎癌移植瘤生长的体内研究  108-112
    3.4 F9 胚胎癌 TCF3 过表达对 Oct4 表达的影响  112-116
  第4节讨论  116-119
    4.1 TCF3 在逆转录病毒载体的克隆表达及意义  116-117
    4.2 TCF3 对胚胎癌细胞生物学行为的影响及可能机制  117-119
  第5节结论  119-120
  参考文献  120-131
附录  131-137
作者简介及在学期间所取得的科研成果  137-139
致谢  139

Egr-hTERTC27联合5-FU治疗鼻咽癌及TCF3抑制小鼠胚胎癌生长的实验研究

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