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腺病毒siRNA干扰抑制RhoA基因及联合TNF-α增加肝癌细胞凋亡的研究

作　者: 李冕
导　师: 闫歌
学　校: 济南大学
专　业: 病原生物学
关键词: RhoA siRNA 腺病毒 HepG2细胞 TNF-α
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的： RhoA基因在多数肿瘤细胞中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关，参与肿瘤细胞的凋亡、侵润和转移等过程。本实验通过构建RhoA基因的腺病毒RNA干扰系统，并联合TNF-α药物观察诱导肝癌细胞的凋亡情况。一方面探讨RhoA基因在肝癌细胞中的功能和作用，另一方面为肿瘤药物联合治疗提供新的研究方向。方法：在本实验室已经构建RhoAsiRNA质粒的基础上，构建RhoA腺病毒siRNA--AdsiRNA-RhoA。制备的重组腺病毒，感染HepG2细胞，通过RT-PCR和Western blot技术检测重组腺病毒对HepG2细胞中RhoA基因表达的影响。单独应用RhoA基因重组腺病毒以及联合TNF-α分别作用于HepG2后，应用MTT法检测HepG2细胞的增殖情况，TUNEL反应检测HepG2细胞的凋亡情况。结果：根据酶切鉴定和序列分析，成功构建RhoA基因的腺病毒siRNA。通过腺病毒siRNA作用，Western blot检测显示，RhoA蛋白表达抑制率为76.48%；RT-PCR结果显示，mRNA转录水平降低74.46%。表明构建的siRNA腺病毒能明显抑制RhoA基因的表达。使用RhoA基因的siRNA腺病毒并联合TNF-α，MTT实验检测结果表明能够有效抑制HepG2细胞生长和增殖；TUNEL检测结果表明能使HepG2细胞凋亡明显。结论：本研究成功建立了RhoA基因的siRNA腺病毒，以及联合细胞因子TNF-α，提高了TNF-α诱导肝癌凋亡的作用，为今后探讨RhoA基因在肝癌细胞中的功能以及肝癌的基因治疗提供了实验依据。

全文目录


研究生导师简介  4-7
摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
主要符号表  10-12
前言  12-15
第一部分 RhoA 基因 siRNA 重组腺病毒的构建  15-31
  一、 材料和方法  15-26
    （一）、实验材料  15-19
      1. 材料试剂  15-16
      2. 仪器和器材  16-17
      3. 试剂配制  17-19
    （二）、实验方法  19-26
      1. 腺病毒载体的构建  19-22
      2. 腺病毒的制备  22-25
      3. 腺病毒的扩增  25
      4. 腺病毒的纯化  25
      5. 腺病毒滴度的测定  25-26
  二、 实验结果  26-31
    1. RhoA 腺病毒 siRNA 的构建  26-29
    2. 腺病毒 AdsiRNA 的制备、扩增  29-30
    3. 腺病毒 AdsiRNA 的纯化、滴度测定  30-31
第二部分 siRNA 腺病毒体外抑制肝癌细胞 RhoA 基因的研究  31-40
  一、 材料和方法  31-37
    （一）、实验材料  31-33
      1. 材料试剂  31
      2. 仪器和器材  31-32
      3. 试剂配制  32-33
    （二）、实验方法  33-37
      1．Western Blot 检测 RhoA 蛋白的表达  33-36
      2. 半定量 PCR 检测 RhoA mRNA 的变化  36-37
  二、 实验结果  37-40
    1. Western Blot 检测 RhoA 蛋白的表达  37-38
    2. 半定量 RT-PCR 检测 RhoAmRNA 的变化  38-40
第三部分 腺病毒干扰联合应用 TNF-α诱导肝癌细胞凋亡  40-47
  一、 材料和方法  40-42
    （一）、实验材料  40
      1. 材料试剂  40
      2. 仪器和耗材  40
      3. 试剂配制  40
    （二）、实验方法  40-42
      1. MTT 检测细胞增殖情况  40-41
      2．采用 TUNEL 反应进行 HepG2 细胞内 DNA 片段化检测  41-42
  二、 实验结果  42-44
    1. MTT 检测细胞增殖  42
    2. TUNEL 反应检测 HepG2 细胞核内 DNA 片段化  42-44
  三、 讨论  44-47
结论  47-48
参考文献  48-51
综述  51-57
  参考文献  56-57
攻读学位期间取得的研究成果  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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