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has-microRNA-212在肝癌中抑制组蛋白去甲基化酶RBP2表达参与肝癌发生发展的机制研究

作　者: 梁修明
导　师: 贾继辉
学　校: 山东大学
专　业: 病原生物学
关键词: RBP2 hsa-miR-212 肝细胞肝癌 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 肿瘤发生
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：研究一种组蛋白去甲基化酶的microRNA调控机制,从而丰富我们对于microRNA分子参与恶性肿瘤发生发展机制的认识,为microRNA作为一种潜在的肿瘤治疗靶位提供一定的参考。方法：1.在组织水平上,我们用实时定量PCR方法检测了20对(肝癌组织和肝正常组织)标本中hsa-microRNA-212的水平,和先前我们检测的RBP2在这些组织中的表达水平进行对比分析,初步确定两者之间的相关性。我们还在这些组织中检测了已知的RBP2下游的靶分子p27kiP1和p16ink4a mRNA的表达水平,进一步分析hsa-microRNA-212, RBP2, p27kip1和p16ink4a这几个分子之间的相关性。2.在分子水平上,我们应用hsa-microRNA-212的高表达质粒和抑制质粒处理肝癌细胞,检测其对RBP2在mRNA和蛋白水平表达的影响,以及这些处理对RBP2下游的靶分子细胞周期依赖性激酶抑制剂(CDKI)p27kip1和p16ink4a的表达水平的影响。我们同时也检测了hsa-microRNA-212的高表达质粒和抑制质粒处理后,肝癌细胞的衰老表现和增殖状况,进一步确定hsa-microRNA-212通过调控RBP2所引起的生物学效应。最后我们通过荧光素酶报告基因分析的方法,检测了hsa-microRNA-212对于RBP2分子mRNA的3’-UTR的作用。具体方法如下：(1).利用罗氏转染试剂把hsa-microRNA-212的高表达质粒和抑制质粒以及各自的对照质粒转入肝癌细胞系HepG-2和SMMC-7721中,48小时后收细胞,用Trizol提取总RNA,再用ABI公司microRNA反转录专用试剂盒反转录RNA后用该公司的专用荧光定量PCR试剂盒检测质粒的转染效率。同时用实时定量PCR检测RBP2及其调控的p27kip1和P16ink4amRNA的表达水平。RBP2蛋白水平的变化用Western Blot方法分析。(2).hsa-microRNA-212的高表达质粒及其对照质粒被转入肝癌HepG-2和SMMC-7721细胞中48小时后,经3%甲醛固定细胞后,进行衰老相关的β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal staining),检测细胞衰老情况。(3).hsa-microRNA-212的高表达质粒及其对照质粒被转入肝癌HepG-2(?)口SMMC-7721细胞中48小时后,进行细胞计数,从每组取300个细胞,放入孵箱培养2周后,进行克隆计数,即进行克隆形成实验检测细胞增殖能力的大小。(4).回复实验：先向HepG-2细胞中转入hsa-microRNA-212的高表达质粒及其对照质粒,24小时后再向细胞中转入RBP2高表达质粒及其对照质粒,48小时后用克隆形成实验检测细胞增殖能力。先向SMMC-7721细胞中转入hsa-microRNA-212的抑制质粒及其对照质粒,24小时后再向细胞中转入RBP2特异性干扰RNA及其阴性对照序列,48小时后用克隆形成实验检测细胞增殖能力。(5).把hsa-microRNA-212的高表达质粒和带有RBP23’-UTR和预测结合位点突变的荧光素酶报告基因分别共转染肝癌细胞系,检钡(?)hsa-microRNA-212对于RBP23’-UTR是否为直接的结合而发挥调控作用。3.在整体动物水平验证hsa-microRNA-212对于RBP2的调节作用从而达到干预肿瘤发生和生长的效果。把10只7周龄的裸鼠平均随机分成两组,每组5只。其中一组注射转染hsa-microRNA-212高表达质粒48小时后的HepG-2细胞,注射量为1X106个细胞／只。对照组注射转染对照质粒48小时后的HepG-2细胞,注射量和前一组相同。观察每组裸鼠肿瘤的形成和生长情况。5周后麻醉处死裸鼠后,分离肿瘤组织,一半冻于-80度冰箱以用于RNA水平检测hsa-microRNA-212和RBP2的表达,另一半浸泡于中性福尔马林以制作石蜡切片,做免疫组化检测RBP2的表达。结果：1.组织水平检测中,在mRNA水平,RBP2的表达在肝癌组织中比肝正常组织中显著升高,且hsa-microRNA-212的表达和正常组织相比,其在肝癌组织中明显表达下调。此外,p27kip1和p16ink4a则在肝癌组织中表现出较低的表达水平。2.肝癌HepG-2和SMMC-7721细胞中转入hsa-microRNA-212高表达质粒48小时后,RBP2的mRNA和蛋白表达都显著下降,同时由于RBP2表达的降低,其下游的p27kip1和p16ink4a表达出现升高现象。3.肝癌HepG-2和SMMC-7721细胞中转入hsa-microRNA-212的抑制质粒48小时后,RBP2的mRNA和蛋白表达都显著上升,同时由于RBP2表达的增高,其下游的p27kip1和p16ink4a表达出现降低现象。4.衰老相关的β-半乳糖苷酶染色表明,在肝癌细胞系中转hsa-microRNA-212高表达质粒48小时后,细胞出现明显的哀老现象。5.克隆形成实验表明,在肝癌细胞系中转入hsa-microRNA-212高表达质粒48小时后,细胞的克隆形成能力明显受到抑制。6.回复实验表明,在HepG-2中转入RBP2高表达质粒能逆转由于hsa-microRNA-212高表达质粒所诱导的细胞克隆形成能力的降低。在SMMC-7721中转入RBP2干扰RNA也能逆转由于hsa-microRNA-212的抑制质粒的所诱导的克隆形成能力的增强。7. hsa-microRNA-212高表达质粒和带有RBP23’-UTR的荧光素酶报告基因的质粒共转染对比于其对照质粒的共转染,荧光素酶活性显著降低。而hsa-microRNA-212高表达质粒和带有预测结合位点突变的RBP23’-UTR的荧光素酶报告基因共转染,相比于hsa-microRNA-212高表达质粒和带有正常的RBP23’-UTR的荧光素酶报告基因共转染,荧光素酶活性则有很大程度上升,即荧光素酶活性得到回复。8.注射有转入hsa-microRNA-212高表达质粒的HepG-2细胞的裸鼠相对于注射转入对照质粒细胞的裸鼠,它们的肿瘤发生率明显降低,肿瘤体积的大小也明显下降,肿瘤系数(肿瘤重量／裸鼠体重)也明显下降。实时定量的结果显示hsa-microRNA-212高表达组裸鼠肿瘤组织中的RBP2明显降低。免疫组化显示hsa-microRNA-212高表达组裸鼠肿瘤组织中的RBP2蛋白表达也明显降低,而其下游的p21CIP2and p27kip1表达却有上升的现象。而且连续切片免疫组化显示,肿瘤组织中RBP2表达高的地方,p21CIP2和p27kip1的表达水平就很低,反之亦然。结论：在肝癌组织中,hsa-microRNA-212可以直接负性调控RBP2的表达,进而影响到其下游的细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂(CDKI)的表达从而参与到了肝癌的发生发展过程。hsa-microRNA-212-RBP2-CDKI信号途径可能在肝癌的发生发展中起了重要作用。

全文目录


中文摘要  5-9
英文摘要  9-12
符号说明  12-13
前言  13-16
实验材料  16-20
实验方法  20-31
结果  31-34
讨论  34-37
结论  37-38
附图表  38-48
参考文献  48-52
致谢  52-53
研究生期间发表和待发表旳论文  53-54
学位论文评阅及答辩情况  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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