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Beclin1是p53调节白藜芦醇诱导人结肠癌HCT-116细胞自噬的关键分子

作　者: 孙雪娟
导　师: 张志勇; 李冠武
学　校: 河北医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 白藜芦醇 HCT-116 p53 自噬 Beclin1
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：白藜芦醇（Resveratrol，RSV）具有多种生物学作用。在体外实验中白藜芦醇可抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡和自噬，但其机制尚不清楚。有研究表明p53能够调节细胞凋亡和自噬，但由于条件差异p53对细胞凋亡和自噬的作用不尽相同。本实验拟通过研究白藜芦醇对HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞生长的影响，检测白藜芦醇作用下细胞自噬情况及p53对细胞自噬的影响、p53与自噬相关蛋白的相互关系以及自噬对细胞生存的影响。方法：1real-time PCR法和western-blot法验证HCT-116p53-/-细胞p53敲除情况，分析HCT-116p53+/+细胞在白藜芦醇作用下p53mRNA和蛋白的表达变化。2用不同浓度白藜芦醇处理对数生长期HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞24h，倒置显微镜下观察两种细胞形态变化。通过MTT法检测不同浓度白藜芦醇处理HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞24h后细胞生存率变化。3免疫荧光检测自噬标志蛋白LC3，观察在白藜芦醇作用后HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞中LC3的表达变化。4western-blot法检测HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3、p-Raptor，分析三者的表达与p53蛋白变化关系。5用p53激动剂Nutlin3与白藜芦醇共同处理HCT-116p53+/+细胞，干扰p53的表达，分析p53与自噬的关系。6运用SPSS13.0统计软件对实验数据进行t检验，均以P<0.05为差异具有显著性统计学意义。结果：1HCT-116p53+/+细胞和HCT-116p53-/-细胞p53基因转录水平p53mRNA在HCT-116p53+/+中表达量为1，而在HCT-116p53-/-中的表达量为0.002±0.002，二者有显著性差异（P<0.05）。0、50、100μM白藜芦醇处理HCT-116p53+/+细胞24h后p53mRNA表达分别为1、2.013、2.171，白藜芦醇100μM处理组与0μM的对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。2不同浓度白藜芦醇作用下观察细胞形态变化0、50、100μM白藜芦醇处理HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞24h后发现未经药物处理的空白对照组细胞饱满、折光性好；50μM白藜芦醇处理组的HCT-116p53+/+细胞突起减少，细胞表面折光略微有所减弱，而HCT-116p53-/-细胞表面颗粒增加，有个别的细胞浮起；100μM白藜芦醇处理组，细胞皱缩，表面凹凸不平。3不同浓度白藜芦醇处理HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞24h后细胞生存率变化在白藜芦醇50μM时，HCT-116p53+/+细胞生存率为91.33%，HCT-116p53-/-细胞生存率为68.67%，HCT-116p53+/+细胞与HCT-116p53-/-细胞相比差别具有统计学意义（P<0.05）；白藜芦醇100μM处理24h后，HCT-116p53+/+细胞生存率为75.33%，HCT-116p53-/-细胞生存率为57%，HCT-116p53+/+细胞和HCT-116p53-/-细胞生存率差别具有统计学意义（P<0.05）。4白藜芦醇作用的HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞中LC3的表达变化。HCT-116p53+/+细胞对照组仅见到蓝色的细胞核，未见红色的LC3蛋白颗粒，HCT-116p53+/+细胞的白藜芦醇100μM处理组可见到蓝色的细胞核和红色的LC3颗粒。HCT-116p53-/-细胞空白对照组可见蓝色细胞核外可见到红色的LC3颗粒，HCT-116p53-/-细胞白藜芦醇100μM处理组与HCT-116p53+/+细胞对照相比红色LC3颗粒有所增加。5不同浓度白藜芦醇处理HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞后自噬相关蛋白p-Raptor、LC3、Beclin1的变化0、50、100μM白藜芦醇处理HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞24h，两种细胞p-Raptor表达增强，HCT-116p53-/-细胞的LC3蛋白表达强于HCT-116p53+/+细胞； Beclin1在HCT-116p53+/+细胞中表达增强，在HCT-116p53-/-细胞中Beclin1表达逐渐降低。6用p53激动剂Nutlin3与白藜芦醇共同处理HCT-116p53+/+细胞p53与自噬的关系Nutlin3作用于HCT-116p53+/+细胞后，p53蛋白表达增加。Nutlin3单独处理HCT-116p53+/+细胞与空白组相比，LC3-I表达有所减弱。Nutlin3与白藜芦醇共同处理组与白藜芦醇单独作用于HCT-116p53+/+细胞相比，LC3-II表达减弱。结论：1白藜芦醇抑制人结肠癌HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-细胞生长，且对HCT-116p53-/-细胞抑制作用明显。2胞浆中的p53大量积累对HCT-116p53+/+细胞自噬有抑制作用。3白藜芦醇诱导人结肠癌HCT-116p53+/+细胞自噬。4Beclin1是p53调控人结肠癌HCT-116细胞自噬向细胞凋亡转换的重要中间分子。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
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