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P125在胃癌组织的表达及胃癌细胞内p21对POLD1的表达调控

作　者: 阮细玲
导　师: 徐恒
学　校: 广西医科大学
专　业: 病理学
关键词: DNA聚合酶δ POLD1 p21 胃癌 细胞周期调控
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 30次
引　用: 1次
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内容摘要


目的：DNA聚合酶δ (polymerase deta, Pol δ)是真核生物DNA复制最重要的DNA聚合酶之一,它由四个亚基组成,其中p125是它的催化亚基,同时具有聚合酶和外切酶功能,p125的编码基因为POLD1,它受到多种蛋白的表达调控。Pol δ的异常与肿瘤的发生有一定的关系,其中表达量的异常及表达调控的变化都有可能导致肿瘤的发生。我们检测胃癌组织内p125的表达水平,以探索p125的表达异常与胃癌的相关性。通过干扰胃癌细胞内POLD1基因的表达,检测细胞增殖速率的改变,进一步验证POLD1基因与肿瘤细胞恶性增殖的关系。p21是最早发现的细胞周期抑制因子,它可以通过依赖或不依赖p53的途径阻滞细胞周期进程。而POLD1的表达是受细胞周期调控的,因此推测p21参与了POLD1的表达调控,并探索p21对POLD1调控的初步模式,为研究POLD1调控的基本网络提供思路,从而为设计阻断细胞恶性增殖的药物提供更特异有效的靶点。方法：1.用免疫组织化学技术检测62例胃癌患者手术切除的癌组织及癌旁组织p125的表达水平,并分析p125在胃癌组织中的表达水平与患者临床病理特征之间的关系。POLD1干扰质粒pGPU6/GFP/neo-POLD1i的构建,是将POLD1干扰靶序列连接到真核绿色荧光蛋白表达载体pGPU6/GFP/neo中。将pGPU6/GFP/neo-POLD1i质粒转染到胃癌细胞MGC-803内,用MTT法检测细胞增殖速率并绘制生长曲线,以探讨POLD1对胃癌细胞增殖速率的影响。同时用细胞免疫组织化学的方法检测P21与p125在胃癌细胞内的亚细胞定位。2.转染p21真核表达质粒pXJ41-p21及p21干扰质粒pGPU6/GFP/neo-p21i到胃癌细胞MGC-803内,经过G418稳定筛选分别构建p21高表达的稳定细胞系803-p21和p21低表达的胃癌稳定细胞系803-p21i。MTT法检测803-p21细胞的增殖速率,流式细胞仪检测803-p21细胞凋亡水平,以验证p21与胃癌细胞增殖及凋亡的关系。3.采用荧光定量实验技术检测803p21、803-p21i细胞内P0LD1及其他相关因子(包括p53、CDK4、CDK2、 PCNA)的相对mRNA水平,Western blot技术检测803-p21、803-p21i细胞内p125及其他相关因子的蛋白表达水平,以研究p21对POLD1的表达调控,及其他相关因子与这种调控的相关性。通过免疫共沉淀实验分析P21与p125的相互作用,以确定两者是否直接结合。转染p53干扰质粒pGPU6/GFP/neo-p53i或CDK4表达质粒pEGFP-CDK4到803-p21细胞,以明确p21是否通过p53或CDK4调控POLD1的表达,并用免疫荧光的方法检测了P53与CDK4蛋白在MGC-803细胞的定位。结果：1.免疫组织化学检测发现p125在胃癌组织的表达显著高于癌旁组织,并且p125的癌组织的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小及淋巴结是否转移等无关。MTT检测细胞增殖速率发现,干扰胃癌细胞MGC-803的POLD1基因表达后的803-POLD1i细胞,与阴性对照组细胞803-NC、空白对照组细胞803相比,生长受到明显抑制。2.MTT实验显示,增强p21表达的胃癌细胞803-p21的增殖速率较阴性对照细胞803-pXJ及空白对照组803明显减慢。流式细胞仪检测细胞凋亡发现803-p21细胞的凋亡率较阴性对照组803-pXJ及空白对照组803高。3.通过荧光定量及western blot分别检测mRNA及蛋白表达发现,进行p21表达干预后,POLD1、CDK2、 CDK4、PCNA的表达与p21呈负相关,而p53与p21呈正相关。免疫共沉淀实验发现,用p125抗体沉淀蛋白复合物时,western blot没有检测到P21蛋白,反之,用P21抗体沉淀蛋白复合物时,western blot亦没有检测到p125。进一步的共转染实验发现,p53干扰表达或CDK4的增强表达均能减弱p21对POLD1表达抑制作用。结论：1.p125在胃癌组织的表达水平显著高于癌旁组织,并且干扰POLD1表达抑制胃癌细胞增殖,推测胃癌细胞的恶性增殖可能与p125过表达相关。2.p21表达增强导致POLD1表达的抑制及胃癌细胞增殖抑制,表明p21可能通过影响POLD1的表达从而抑制胃癌细胞的增殖。3.p21通过p53、CDK4(?)司接调控POLD1的表达；同时p21对POLD1的调控与CDK2、PCNA等因子有关。

全文目录


主要英文縮略语表  4-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-17
材料和方法  17-45
结果  45-58
讨论  58-67
结论  67-68
参考文献  68-75
综述  75-91
  参考文献  85-91
致谢  91-92
攻读硕士期间已发表及待发表的文章  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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