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高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ（GMⅡ）在胃癌细胞生长中的作用及机制研究

作　者: 杨雅莹
导　师: 易永芬
学　校: 重庆医科大学
专　业: 组织工程与细胞工程
关键词: GMⅡ 胃癌 生长 增殖 凋亡
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：成功构建GMⅡ基因过表达载体与RNAi表达载体并分别稳定转染胃癌细胞株；通过体内外实验观察过表达与沉默GMⅡ基因对胃癌细胞株生长的影响；初步探讨GMⅡ基因在胃癌细胞生长作用中可能涉及的分子机制。方法：1、通过RT-PCR、Westernblot分别检测人永生化胃粘膜上皮GES-1、胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-28的GMⅡmRNA及蛋白表达水平，筛选出GMⅡ低表达与高表达的胃癌细胞株作为实验用株。2、构建GMⅡ基因过表达载体并测序验证；设计3条靶向GMⅡ的siRNA并合成GMⅡ-shRNA-1、GMⅡ-shRNA-2、GMⅡ-shRNA-3及阴性对照shRNA-NC，shRNA退火后与线性化的质粒载体相连接并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，重组质粒载体扩增并提取后进行酶切测序鉴定。3、通过脂质体LipofectAMINE2000介导，将GMⅡ基因过表达载体转染GMⅡ低表达的胃癌细胞株；GMⅡ-shRNA-1、GMⅡ-shRNA-2、GMⅡ-shRNA-3及GMⅡ-shRNA-NC表达载体转染GMⅡ高表达的胃癌细胞株，应用荧光倒置显微镜对转染效果进行评价；通过RT-PCR、Westernblot检测瞬时转染胃癌细胞株后GMⅡmRNA及蛋白表达水平，进一步验证GMⅡ基因过表达载体的成功构建，同时筛选出干扰效果最好的表达载体用于后续实验研究；经G418筛选以获得稳定转染GMⅡ基因过表达载体与RNAi表达载体的胃癌细胞株。4、MTT法检测GMⅡ基因过表达与沉默后胃癌细胞株增殖活性的改变，流式细胞术分析细胞周期分布的改变；Hoechst33258染色及AnnexinV/PI合染并流式细胞术检测GMⅡ基因过表达及沉默后胃癌细胞株凋亡率的改变。5、将GMⅡ基因稳定过表达及沉默的胃癌细胞株接种至裸鼠皮下，观察移植瘤的生长速度并绘制肿瘤生长曲线，将移植瘤剥除后通过免疫组织化学检测GMⅡ蛋白的表达。6、通过RealtimePCR及Westernblot检测GMⅡ基因过表达及沉默后胃癌细胞株增殖与凋亡相关基因CyclinD1、Bcl-2、c-mycmRNA及蛋白水平的改变，同时检测MAPK通路中ERK1/2、p-ERK1/2的改变。结果：1、GMⅡ基因与蛋白在胃癌细胞株MKN-28中表达最低，而在胃癌细胞株BGC-823中表达最高，因此筛选BGC-823、MKN-28为实验用细胞株。2、酶切测序表明GMⅡ基因的过表达载体及3条GMⅡ-shRNA表达载体构建成功。3、将GMⅡ基因的过表达载体转染胃癌细胞株MKN-28，GMⅡ-shRNA-1、GMⅡ-shRNA-2、GMⅡ-shRNA-3及GMⅡ-shRNA-NC表达载体转染胃癌细胞株BGC-823，转染后细胞在荧光倒置显微镜下发出绿色荧光；与空白对照组及转染空质粒组相比，过表达载体转染后胃癌细胞株MKN-28的GMⅡmRNA及蛋白水平明显升高（P<0.05）；与空白对照组、转染空质粒组及转染GMⅡ-shRNA-1、GMⅡ-shRNA-3及GMⅡ-shRNA-NC组相比，GMⅡ-shRNA-2表达载体转染后胃癌细胞株BGC-823的GMⅡmRNA及蛋白水平明显降低（P<0.05）；经G418筛选后获得稳定表达GMⅡ基因的胃癌细胞株MKN-28及稳定表达GMⅡ-shRNA-2的胃癌细胞株BGC-823。4、MTT法及流式细胞术检测结果显示，与空白对照组及转染空质粒组细胞相比，转染GMⅡ基因过表达载体的胃癌细胞株MKN-28生长速度明显增加，并且S期细胞比例显著增加（P<0.05）；转染GMⅡ-shRNA-2表达载体的胃癌细胞株BGC-823生长速度明显减慢，并且G1期细胞比例显著增加（P<0.05）。Hoechst33258染色及AnnexinV/PI合染并流式细胞术检测结果显示，与空白对照组及转染空质粒组细胞相比，转染GMⅡ基因过表达载体的胃癌细胞株MKN-28凋亡率明显降低（P<0.05）；转染GMⅡ-shRNA-2表达载体的胃癌细胞株BGC-823凋亡率明显升高（P<0.05）。5、裸鼠体内成瘤实验结果显示，与空白对照组及转染空质粒组细胞接种裸鼠后形成的移植瘤相比，转染GMⅡ基因过表达载体的胃癌细胞株MKN-28接种裸鼠后形成的移植瘤重量及体积明显增加（P<0.05），移植瘤GMⅡ蛋白的表达明显增强（P<0.05）；转染GMⅡ-shRNA-2表达载体的胃癌细胞株BGC-823接种裸鼠后形成的移植瘤重量及体积明显降低（P<0.05），移植瘤GMⅡ蛋白的表达明显减弱（P<0.05）。6、RealtimePCR及Westernblot结果显示，与空白对照组及转染空质粒组细胞相比，转染GMⅡ基因过表达载体的胃癌细胞株MKN-28增殖与凋亡相关基因CyclinD1、c-mycmRNA与蛋白表达水平明显增加（P<0.05），而Bcl-2mRNA与蛋白表达水平三组之间无显著性差异（P>0.05），MAPK通路中p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P<0.05）；转染GMⅡ-shRNA-2表达载体的胃癌细胞株BGC-823增殖与凋亡相关基因CyclinD1、c-mycmRNA与蛋白表达水平明显降低（P<0.05），而Bcl-2mRNA与蛋白表达水平三组之间无显著性差异（P>0.05），MAPK通路中p-ERK1/2蛋白表达明显降低（P<0.05）。结论：GMⅡ通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡而促进胃癌细胞的生长；增殖与凋亡相关基因CyclinD1、c-myc及MAPK信号转导通路可能参与了GMⅡ在胃癌细胞生长中的作用；GMⅡ可能成为研究胃癌发生发展分子机理的重要靶点。

全文目录


英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-17
前言  17-20
第一部分 GMⅡ基因过表 达载体与R N A i表达载体 的构建及其鉴定  20-51
  1 材料与方法  20-37
  2 结果  37-47
  3 讨论  47-51
第二部分 GMⅡ基因在胃癌细胞生长中的作用  51-71
  1 材料和方法  51-56
  2 结果  56-68
  3 讨论  68-71
第三部分 GMⅡ基因在胃癌细胞生长中的作用机制  71-86
  1 材料与方法  71-75
  2 结果  75-81
  3 讨论  81-86
全文总结  86-88
参考文献  88-95
文献综述  95-109
  参考文献  102-109
致谢  109-110
攻读博士学位期间获得的研究课题  110
攻读博士学位期间发表的文章  110

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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