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PC4与肺腺癌淋巴管生成VEGF-C/D-VEGFR-3通路分子相关性的体外实验研究

作　者: 陶绍霖
导　师: 谭群友
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 转录辅助因子4 VEGF-C/D-VEGFR-3信号通路 新生淋巴管形成 肺腺癌
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


背景与目的肿瘤的复发和转移是影响肺癌患者生存和预后的重要因素，淋巴转移是肺腺癌的常见转移途径。目前对肺癌淋巴转移发生的分子机制尚未完全阐明。转录辅助因子4(positive cofactor4，PC4)是一种广泛的辅助激活因子，通过对转录因子的影响来诱导肿瘤转化，是肺癌发生发展及淋巴转移的相关因子。VEGF-C、VEGF-D是淋巴管生成有力的诱导剂，两者可与其受体VEGFR-3特异性结合，介导和启动VEGF-C/D-VEGFR-3信号通路，参与肿瘤细胞淋巴转移、淋巴管生成的调节。PC4与VEGF-C、VEGF-D均可促进肿瘤细胞向淋巴结转移，对肿瘤的发展具有推动作用。本研究以肺腺癌A549细胞为研究对象，通过RNA干扰技术下调PC4表达，并采用qRT-PCR和Western blot技术方法检测RNA干扰前后PC4、VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的mRNA和蛋白表达改变，分析它们之间的相关性，为进一步体内实验和以PC4为靶点的分子治疗研究提供实验依据。研究方法通过RNA干扰技术，针对PC4基因特异性设计4对干扰靶点，并构建重组pSES-HUS-PCi质粒，采用Lipofectamine2000转染入293T细胞，qRT-PCR和Westernblot检测干扰前后PC4mRNA和蛋白表达，筛选出最佳干扰靶点，并以此构建慢病毒包裹的重组质粒，感染目的细胞A549后，获得稳定低表达PC4的肺腺癌细胞株，qRT-PCR和Western blot检测干扰前后PC4、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3mRNA和蛋白表达情况，分析PC4与VEGF-C/D-VEGFR-3信号轴分子的相互关系。结果成功构建重组质粒表达载体pSES-HUS-PCi。经qRT-PCR和Western blot检测发现pSES-HUS-PCi1重组质粒中PC4siRNA (正义，5′-AACAGAGCAGCAGCAGCAGATTTT-3′;反义，5′-ATCTGCTGCTGCTGCTCTG TTTT-3′) mRNA和蛋白相对表达明显下降，抑制率为85.30%和80.57%，为针对PC4基因的最优siRNA序列。将上述PC4siRNA合成并构建慢病毒载体质粒，感染A549细胞，获得稳定低表达PC4的A549pGCL-siRNA PC4细胞株及对照A549pGCL-siRNA control PC4细胞株。干扰A549中PC4表达后，qRT-PCR和Western blot检测表明，干扰组PC4mRNA和蛋白的表达显著低于未干扰组及对照组(P＜0.05)。而PC4表达的下调后，VEGF-C、VEGF-D及VEGFR-3mRNA和蛋白的表达量亦随之下调，其在干扰组的表达量明显低于未干扰组和随机对照组(P＜0.05)。统计学分析表明PC4mRNA表达与VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3mRNA的表达呈正相关(r=0.792,P=0.005；r=0.592,P=0.046；r=0.661,P=0.026)；PC4蛋白表达与VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表达呈正相关(r=0.966,P=0.000；r=0.812,P=0.004；r=0.856,P=0.003)。结论(1)PC4siRNA(正义，5′-AACAGAGCAGCAGCAGCAGATTTT-3′;反义，5′-ATCTGCTGCTGCTGCTCTGTTTT-3′)是针对PC4基因的特异性siRNA序列；(2)在肺腺癌A549细胞中，伴随PC4表达的下调，VEGF-C、VEGF-D及VEGFR-3的表达量亦随之下调，PC4与VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表达呈正相关；(3)PC4可能作为VEGF-C、VEGF-D的上游分子，参与调节肺腺癌淋巴管生成VEGF-C/D-VEGFR-3信号通路，在肺腺癌淋巴转移中发挥重要作用。

全文目录


英文缩写索引  4-6
Abstract  6-8
摘要  8-10
前言  10-11
材料和方法  11-27
实验结果  27-34
讨论  34-39
全文结论  39-40
致谢  40-41
参考文献  41-46
文献综述一 VEGF-C/D-VEGFR-3 信号通路在淋巴管生成及肺癌淋巴转移中的作用研究进展  46-54
  参考文献  50-54
文献综述二 转录辅助因子 PC4 的生物化学特点及其与肿瘤发生发展的关系  54-62
  参考文献  58-62
硕士期间发表论文  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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