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人骨髓间充质干细胞对肺癌细胞增殖转移及自噬凋亡的调控作用研究

作　者: 张明慧
导　师: 胡义德
学　校: 第三军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 肺癌细胞肺癌人骨髓间充质干细胞增殖侵袭转移凋亡自噬血清剥夺共培养
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：肺癌目前已成为严重危及人类的健康的重大疾病，居常见恶性肿瘤中死亡率之首。肺癌起病隐匿，临床确诊患者80%已属晚期，失去手术根治机会。随着新型化疗药物以及分子靶向药物的临床应用，使很多肺癌患者临床获益，改善了生存质量，延长了生存期，但5年生存率仍然很低。因此，寻找更加有效的治疗手段成为亟待解决的难题。人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)是存在于骨髓中多能祖细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，在多种结缔组织的维持和修复中起着至关重要的作用。当人体遭受到损伤或者慢性炎症时，hMSCs可作为组织修复的细胞来源，机体受创时所释放的特殊内分泌信号可被转运到骨髓，从而启动具有多向分化潜能的hMSCs再循环到受创部位以修复机体。同时研究证明，肿瘤微环境和正常组织受损时的微环境有很多相似之处，hMSCs亦可通过再循环路径到达肿瘤组织。基于这一科学研究发现，已有学者开展将hMSCs作为载体细胞用于肿瘤的基因靶向治疗研究。因此，明确hMSCs在肺癌细胞生长中的作用，对于评估hMSCs的临床应用前景尤为重要。关于hMSCs对肿瘤细胞影响的系统研究较少，特别是关于hMSCs对肺癌细胞影响研究甚少。本研究分别行体内体外实验研究，建立hMSCs和肺癌细胞共培养模型，明确了hMSCs对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并初探可能的机制。同时，研究表明随着实体肿瘤的不断增殖，肿瘤微环境不可避免的会出现缺血缺氧状态。因此，在肿瘤的治疗中，营养缺乏状态下肿瘤细胞的生存状态是必然需要密切关注的环节之一。缺血缺氧等代谢应激状态下，细胞自噬是对外部环境变化的有效反应，细胞通过降解受损胞质蛋白、分子和细胞器，为细胞的存活提供营养来源，对细胞的存活和死亡起着举足轻重的作用。越来越多的证据表明，自噬与肿瘤发生、肿瘤进展和耐药之间具有密不可分的关系。对癌细胞自噬的调控可能参与肿瘤细胞在代谢应激下的生存机制。因此研究hMSCs对肿瘤的作用，必然需要关注营养缺乏下肿瘤细胞的生存状态极其可能的保护机制，而对于这方面的研究及可能的机制研究目前仍属空白。因此，本研究通过无血清饥饿诱导建立细胞代谢应激模型，行同时通过体内体外实验研究，检测hMSCs对肺癌细胞增殖能力的影响，并探讨hMSCs对肺癌细胞自噬和凋亡的调控作用，以期阐明hMSCs在不同生长条件下对肺癌细胞的影响。研究方法：1．HMSCs的分离培养及鉴定利用密度梯度离心分离法分离培养健康成人志愿者髂骨骨髓，使用差速贴壁传代培养纯化hMSCs，行流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测hMSCs相关表面标志物，鉴定培养细胞纯度；行多项分化能力鉴定：通过成骨诱导培养基、成脂诱导培养基、成软骨诱导培养基行所获得细胞多项分化培养，并通过茜素红染色鉴定成骨能力，油红O染色鉴定成脂能力，阿尔新蓝染色鉴定成软骨能力。2．HMSCs对A549、SPC-1细胞增殖能力影响的体内外实验研究利用A549、SPC-1两种肺癌细胞株，通过transwell小室间接培养模式，检测hMSCs对A549细胞、SPC-1细胞的增殖能力、细胞周期变化、细胞凋亡情况的影响，检测PCNA、Cyclin-D1、VEGF蛋白表达的变化，同时建立裸鼠移植瘤模型，观察hMSCs对移植瘤生长的影响，检测移植瘤CD34表达变化；系统探讨hMSCs对肺癌细胞体内外增殖能力及血管生成能力影响。3．HMSCs对A549、SPC-1细胞侵袭转移能力的体内外实验研究利用A549、SPC-1两种肺癌细胞株，通过transwell小室间接培养模式，观察A549、SPC-1侵袭迁移能力影响，western blot检测A549细胞、SPC-1细胞侵袭迁移相关MMP-2和MMP-9蛋白表达的变化，同时建立裸鼠腹腔转移瘤模型并行hMSCs定期腹腔注射，观察hMSCs对肺癌细胞体内侵袭转移能力的影响，检测移植瘤MMP-2、MMP-9蛋白表达变化，系统探讨hMSCs对肺癌细胞体内外侵袭转移能力的影响。4．HMSCs对A549、SPC-1细胞自噬与凋亡的调控作用利用A549、SPC-1两种肺癌细胞株，通过transwell小室间接培养模式，行A549、SPC-1饥饿诱导，检测诱导后hMSCs对肺癌细胞增殖能力、凋亡和自噬的变化情况；采用3-MA自噬抑制剂抑制自噬后检测肺癌细胞凋亡和自噬的变化情况；并行凋亡自噬相关蛋白Bcl-2，Beclin-1表达情况检测，阐明hMSCs在饥饿状态下对肺癌细胞中的凋亡和自噬的调控作用。研究结果：1．成功分离鉴定hMSCs从健康成人志愿者髂骨骨髓通过体外分离培养得到形态均一贴壁生长的hMSCs，流式细胞术行细胞表面抗原标志物检测此群细胞CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR为阴性表达(<5%), CD73, CD90,和CD105为阳性(>95%)，符合hMSCs表面标志物特点；分化培养显微镜下观察成骨、成脂、成软骨能力，经茜素红、油红O、阿尔新蓝染色确认其具有良好的成骨、成脂、成软骨能力。此结果说明分离培养的细胞符合hMSCs的国际通用鉴定标准。2．hMSCs体外抑制A549、SPC-1细胞增殖，体内促进移植瘤增殖Transwell小室间接培养模式发现hMSCs可在体外可抑制A549细胞增殖速率，调控细胞周期进程，使大部分细胞周期阻滞于G0/G1期，S期细胞减少，western blot检测PCNA和Cyclin-D1表达降低，说明hMSCs通过抑制PCNA和Cyclin-D1的表达使A549、SPC-1细胞发生G0/G1期阻滞而起作用；体内移植瘤实验发现hMSCs可促进肺癌细胞增殖，免疫组化发现移植瘤CD34表达量升高，结合western blot检测VEGF蛋白含量升高结果提示体内促进增殖原因源于hMSCs促进肿瘤血管生成。3.离体、在体实验显示hMSCs抑制A549、SPC-1细胞侵袭转移Transwell小室侵袭迁移实验发现在hMSCs间接共培养作用下A549和SPC-1侵袭能力有所减弱，建立皮下移植瘤转移模型和腹腔种植转移的模型，发现hMSCs对肿瘤细胞转移能力具有抑制作用,western blot和移植瘤免疫组化检测到MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，初步证实hMSCs可抑制A549和SPC-1的侵袭转移能力，其机制可能通过抑制MMP-2和MMP-9表达起作用。4. hMSCs可诱导A549、SPC-1细胞自噬，抑制凋亡体外通过transwell小室间接培养模式，发现在饥饿状态下hMSCs可使肺癌细胞获得更好增殖活力，细胞凋亡率减少，自噬发生率明显升高，当采用3-MA自噬抑制剂抑制自噬后，细胞凋亡率明显升高；通过免疫荧光和western blot检测发现hMSCs可使肺癌细胞Bcl-2表达下降，Beclin-1表达升高，其诱导自噬的发生可能与其抑制Bcl-2表达，增加自噬相关调节因子Beclin-1表达相关。体内实验发现联合hMSCs肺癌细胞有成瘤更早且移植瘤体积更大，移植瘤LC3Ⅱ的免疫组化检测发现hMSCs可在体内诱导肺癌细胞自噬的发生。结论：1.成功分离纯化贴壁培养hMSCs，通过表面标志特点及三向分化能力鉴定说明hMSCs的符合人hMSCs国际通用鉴定标准。2. hMSCs在体外体内对肺癌细胞增殖能力具有双重作用，体外抑制肿瘤增殖，可能通过抑制PCNA和Cyclin-D1的表达使A549、SPC-1细胞发生G0/G1期阻滞而起作用；体内促进肿瘤增殖，可能源于通过增加VEGF的表达促进肿瘤血管生成。3. hMSCs在体外体内具有抑制肺癌细胞侵袭迁移能力的作用，其抑制机制可能通过抑制MMP-2和MMP-9表达起作用。4. hMSCs可在饥饿状态下诱导肺癌细胞发生自噬以抑制凋亡，促进肺癌细胞增殖；其诱导自噬的发生可能与其抑制Bcl-2表达，增加自噬相关调节因子Beclin-1表达相关。

人骨髓间充质干细胞对肺癌细胞增殖转移及自噬凋亡的调控作用研究

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