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激活突变SHP-2酪氨酸磷酸酶促进砷导致的MEFs恶性转化和裸鼠成瘤风险

作　者: 陈吉
导　师: 汪思应
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: SHP-2 As2O3 C3G 激活突变 肿瘤发生 环境因素 遗传因素
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


【背景及目的】恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一，近年来呈现发病率升高及发病早龄化的趋势。多项研究提示，肿瘤的发生（tumorigenicity）受到环境因素（environmentalfators）和遗传因素（genetic factors）共同调控，并且是一个多因素，复杂的长期过程。因此对其内外因素在肿瘤发生过程中作用机制的研究显得尤为重要。SHP-2（Src homology2-containing protein tyrosine phosphatase,SHP-2）是一种广泛存在与哺乳动物多种组织细胞中的非受体型酪氨酸磷酸酶，参与细胞的存活、迁移、粘附、细胞骨架形成等生理过程。研究表明，其突变体在努南综合征（Noonan syndrome,伴髓系异常增殖病），髓系增殖病，幼年型粒单细胞白血病（Juvenile myelomonocytic leukemia, JMML）及其他白血病和一些实体瘤的发生发展中发挥重要作用。本课题组一直致力于研究SHP-2蛋白（由PTPN11编码）在白血病及实体瘤发生发展中的作用。并且我们发现SHP-2激活突变（gain-of-functionmutation, GOF mutation）可能参与环境因素导致的小鼠白血病、实体瘤等恶性疾病的发生。D61G/D61Y的激活是SHP-2最常见的激活突变体，Neel实验室通过计算机模拟技术发现D61G突变使SHP-2活性发生一定程度增强，并且他们建立了此SHP-2D61G/+基因敲入小鼠模型，发现小鼠出现努南综合征的表征、并伴随髓系异常增殖，出现脾脏肿大等症状，但是却没有白血病等恶性疾病的发生。我们设想可能因为此小鼠饲养在SPF（Specific pathogen free）级环境中，没有接触任何外界环境污染物，所以才没有发生白血病等恶性疾病。于是我们使用MNU（methylnitrosourea）处理此模型小鼠，流式检测结果显示小鼠白血病发病率明显升高。但是在日常生活中人们不可能接触到如此高剂量、高纯度的DNA损伤剂。查阅相关文献及流行病学资料，我们选用一种类金属污染物As2O3（Arsenictrioxide），来处理MEFs(SHP-2+/+)和MEFs(SHP-2D61G/+)细胞，以观察在As2O3导致MEFs细胞恶性转化及裸鼠体内实体瘤形成的过程中，SHP-2激活突变扮演怎样的角色。砷是国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer, IARC）确认的化学致癌物。有研究表明砷及其代谢产物，可以诱导产生ROS（Reactive oxygenspecies），引起氧化应激，进而通过导致DNA损伤、异常活化多种信号通路等机制，来促进肿瘤的发生。为了进一步探讨在As2O3和SHP-2D61G/+导致MEFs细胞恶性转化过程中ROS是否参与，我们使用矢车菊-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside，C3G）作为ROS抑制剂与As2O3联合处理MEFs细胞，观察ROS抑制后细胞生物学行为及裸鼠体内实体瘤形成情况的变化。【方法】1用0.5μM As2O3和20μM C3G处理已建立的SHP-2+/+和SHP-2D61G/+MEFs细胞，构建稳定的转化细胞模型。2用MTT和平板克隆形成实验检测转化细胞生长情况，用流式细胞术检测转化细胞增殖周期的变化，用软琼脂集落形成实验检测转化细胞非锚定生长能力，用粘附试验和Transwell迁移实验检测转化细胞粘附和迁移能力；用裸鼠成瘤实验检测转化细胞体内成瘤能力。3用5μM As2O3和20μM C3G处理MEFs细胞，流式细胞术检测细胞ROS水平的变化。4用5μM As2O3急性处理SHP-2+/+和SHP-2D61G/+MEFs细胞，Western blotting检测Erk、P38、JNK、Akt的活化情况。【结果】1成功构建了As2O3和C3G处理的MEFs转化细胞模型。2MTT和克隆形成实验检测结果提示，低剂量As2O3处理促进了细胞的生长增殖能力，并且SHP-2激活突变对此效应起正调控作用。3细胞周期检测发现，低剂量As2O3处理导致处于S期的细胞比例增高；而SHP-2激活突变加剧此效应。4低剂量As2O3处理促进了MEFs细胞非锚定生长能力，而SHP-2激活突变在此过程中发挥促进作用。实验结果显示，与对照组相比，As2O3处理组集落形成个数明显增加并且体积更大；尤其是SHP-2激活后此效应更为显著。5粘附和Transwell迁移实验结果表明，低剂量As2O3处理导致细胞粘附和迁移能力增强，并且SHP-2激活突变加剧此效应。6SHP-2激活突变在低剂量As2O3导致MEFs细胞裸鼠体内成瘤过程中发挥促进作用。7相关机制初步探讨发现，As2O3和SHP-2D61G/+导致MEFs恶性转化，可能与MAPK/ERK，MAPK/JNK，MAPK/P38，PI3K/ATK的活化有关。8As2O3急性处理即可刺激MEFs细胞产生ROS，SHP-2激活突变可以促进ROS的产生；而C3G可以显著降低ROS水平。9C3G处理可以显著抑制As2O3导致的MEFs恶性转化及裸鼠成瘤的风险。同样运用上述细胞生物学实验检测发现，C3G抑制ROS后，As2O3处理促进MEFs细胞生长增殖、粘附、迁移、克隆形成及非锚定生长能力的情况均得到一定程度的抑制。并且裸鼠体内成瘤实验也得到类似结果。【结论】1低剂量As2O3可以促进MEFs细胞恶性转化及裸鼠成瘤，在此过程中SHP-2激活突变发挥正调控作用。2As2O3和SHP-2D61G/+促进MEFs细胞的恶性转化可能有MAPK/ERK，MAPK/JNK，MAPK/P38，PI3K/ATK信号通路的参与。3C3G可以通过抑制ROS水平，从而一定程度的抑制As2O3和SHP-2D61G/+导致的MEFs细胞恶性转化及裸鼠成瘤。

全文目录


中英文缩写一览表  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-13
前言  13-17
第一部分 As_3O_2处理 MEFs 转化细胞模型的建立及 As_3O_2和 SHP-2 激活突变对细胞恶性生物学行为的影响及其机制的初步探讨  17-38
  1 引言  17
  2 实验材料与方法  17-25
  3 结果  25-33
  4 讨论  33-37
  5 结论  37-38
第二部分 C3G 能够抑制 As_2O_3暴露所致的 MEFs 细胞恶性转化和裸鼠成瘤  38-67
  1 引言  38
  2 实验材料与方法  38-41
  3 结果  41-48
  4 讨论  48-50
  5 结论  50
  参考文献  50-67
附录  67-68
  个人简历  67
  论文发表情况  67-68
致谢  68-69
综述  69-81
  参考文献  76-81

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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