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Rho/ROCK分子与合体滋养细胞微绒毛膜脱落及重度子痫前期发病关系的研究

作　者: 杨博萍
导　师: 李力
学　校: 第三军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: Rho ROCK STBM 胎盘低氧
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景和目的：重度子痫前期（severe preeclampsia，sPE）是严重威胁孕产妇和胎儿健康的重要产科并发症之一。由于目前的研究成果尚不能对sPE的发病进行准确预测，而精确调节滋养细胞侵袭行为以纠正sPE的解剖病理基础尚无可观前景，因此考虑如何干预、阻断发病后的病理生理过程对于sPE的临床治疗更具意义。sPE孕妇的血清或血浆可以干扰血管内皮细胞的功能，提示sPE患者外周血中存在引发临床症状的重要因子。胎盘娩出后其临床症状迅速消失，说明sPE外周血不良因子主要来自于胎盘。合体滋养细胞微绒毛膜（syncytiotrophoblast microvillous membrane，STBM）是胎盘源性不良因子之一，是合体滋养细胞凋亡或被激活时产生的带膜囊泡状结构，脱落至母体血液循环的STBM可作用于外周血管，导致血管内皮细胞失功能，同时通过调节机体炎性因子释放和调控细胞免疫等多种途径影响母体免疫系统，目前被认为是sPE发病的重要因素。已有研究表明，sPE患者外周血STBM浓度显著增高，在早发型sPE则更为明显，但其脱落机制尚不清楚，值得注意的是，STBM在妊娠妇女外周血即可以测得，而在未妊娠妇女外周血中检测不到，说明STBM的释放行为本身是正常妊娠过程中的生理现象，sPE时由于某种因素的介导使其脱落上调，从而达到致病作用。国内外研究提示：低氧可能是STBM脱落的主要诱发因素。Rho/ROCK信号通路由Rho亚家族蛋白（Ras homologue protein family）及其下游分子ROCK（Rho-associated protein kinase）组成，广泛参与细胞的信号转导过程，通过作用于下游分子参与细胞的增殖、凋亡、迁移等多种生物学过程。已证实，Rho/ROCK信号通路参与sPE的发病过程，且sPE患者胎盘组织RhoA、ROCKII蛋白高表达。已有研究证实低氧可激活Rho/ROCK信号通路，尤其上调RhoB和ROCKI的表达。鉴于sPE发病过程中存在胎盘缺血缺氧、低灌注的这一重要病理环境，我们推测，Rho/ROCK很可能参与调控sPE时低氧介导的STBM脱落上调，且ROCK两种亚型在其中的作用可能不同，但目前为止，Rho亚家族蛋白及ROCK在sPE胎盘组织的亚型表达特点尚不明确，其与STBM脱落的关系及可能存在的作用机制也不明了。本研究基于体外胎盘绒毛组织低氧培养实验平台，应用电镜、免疫组化、Westernblot、ELISA等实验技术，研究并探讨Rho/ROCK分子与STBM脱落及sPE发病的关系。材料和方法：1.研究对象及分组选择2009年1月～2010年9月在第三军医大学大坪医院和新桥医院产科行剖宫产分娩的产妇40例，每位患者都签署知情同意书。重度子痫前期组（severe preeclampsia，sPE）20例，正常对照组（normal pregnancy，NP）20例，两组孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义（P>0.05），均行剖宫产，均为单胎妊娠，无糖尿病、心脏病、慢性肾病、肝病以及免疫性疾病等病史。2.标本采集与预处理胎盘娩出后，无菌条件下剪取胎盘母体面中央无钙化区组织约1.0cm³大小，弃除胎盘底蜕膜，用PBS漂洗干净，置于无菌纱布上浸干，部分标本置于液氮罐冻存；部分以2.5%戊二醛固定，部分以4%多聚甲醛固定。3.体外胎盘绒毛组织低氧培养当胎盘娩出后避开钙化区组织取约1.0cm³大小，用无菌生理盐水漂洗干净后，剪去蜕膜组织并剥离弃除血管，将绒毛组织剪成0.1cm³的小块，称每孔的绒毛组织重量，每孔约为60mg，接种到24孔细胞培养板中，加5mL培养液（DMEM/F12+10%胎牛血清+双抗），分别在37℃、5％O₂（体积分数）+95%N₂混合气的低氧箱和37℃、5%CO₂和95％空气的恒温培养箱中培养；培养0.5h、1h、2h、3h、6h、12h后分别收集组织及上清液。实验组分为常氧组（Normoxia）与低氧组（Hypoxia）。4.透射电镜样本观察将胎盘组织样本用2.5%戊二醛固定2h后，取出，用2%锇酸后固定，环氧树脂包埋，再行超薄切片，醋酸铀及枸椽酸铅双染色，每张切片加速电压80KV，放大倍率为10000。观察胎盘合体滋养细胞微绒毛结构变化。5.体视学参数测算方法用Image Pro图像分析软件设计方网测试系统进行分析，方网的点间距为20个像素。测试前，首先用电镜照片标尺对该网格进行标定，以合体滋养细胞为参照系，用上述方网测试系统测试击中微绒毛及包容空间的测试点数，计数测试线与微绒毛的交点数，分别计数测试，区域内的合体滋养细胞微绒毛数密度（numerical density，Nv，个/μm³），表面积密度（surface density，Sv，μm²/μm³）及体积密度（volume density，Vv，μm³/μm³），计算测试的各个体视学参数。6.免疫组化检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII蛋白的定位将胎盘组织用4%多聚甲醛中固定24h后，石蜡包埋、切片。采用免疫组化ABC法检测胎盘组织中RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII蛋白表达。参照免疫组化试剂说明书，严格按照步骤进行。一抗（Rabbit polyclonal to RhoA、RhoB、RhoC、ROCKII，1:1500；Rabbit polyclonal to ROCKI，1：500）4℃过夜，以PBS液代替一抗做阴性对照，DAB染色后，用苏木素复染，常规脱水、透明、干燥。光镜下观察组织中出现棕黄色颗粒为阳性。7. Western blot检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII的表达按常规方法从胎盘组织中提取蛋白，SDS-PAGE步骤按常规操作，电泳（100mV，1.5h）；封闭（5%的脱脂牛奶，1h）。应用单克隆抗体（Rabbit polyclonal to RhoA、RhoB、RhoC，1:2000； Rabbit polyclonal to ROCKI、ROCKII，1:300）孵育，再与过氧化物酶标记的二抗孵育，应用化学增强发光方法显示条带。应用Quantity-one4.62软件对凝胶电泳条带进行灰度值分析，以目的条带和内参条带的比值作为目的蛋白表达的相对含量。8. ELISA检测STBM的脱落水平应用STBM表面标记-人胎盘碱性磷酸酶（placental alkaline pkosphatase，PLAP）ELISA试剂盒（Human STBM–ELISA试剂盒）检测STBM的脱落水平。结果：1.胎盘合体滋养细胞微绒毛体视学参数NP组胎盘中合体滋养细胞微绒毛数密度、表面积密度及体积密度均高于sPE组，sPE组胎盘合体滋养细胞微绒毛数目明显少于NP组（P﹤0.05）；且Hypoxia组胎盘合体滋养细胞微绒毛数目明显少于Normoxia组（P﹤0.05）。2. RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII在胎盘组织中的定位RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII蛋白在四组胎盘中合体滋养细胞、细胞滋养细胞、内皮细胞和一些基质细胞的胞质中均有表达（棕黄色颗粒为阳性表达），但主要表达在合体滋养细胞胞质中。3. RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII在胎盘组织中的表达sPE组RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKII蛋白表达水平高于NP组（P <0.05）；Hypoxia和Normoxia组0.5h RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKII蛋白表达开始增多，3h增高明显，6h升高达高峰，12h下降，且Hypoxia组RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKII蛋白表达水平高于Normoxia组（P <0.05）；而RhoC蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）。4.体外胎盘绒毛组织培养上清液中STBM的脱落水平胎盘绒毛组织培养0.5h STBM脱落水平开始升高，6h达高峰，12h开始下降，且Hypoxia组明显高于Normoxia组（P <0.05）。结论：1.通过电镜观察及Image Pro软件分析，发现sPE胎盘合体滋养细胞表面微绒毛体视学参数较之正常妊娠显著下调，同时应用低氧条件模拟sPE发病微环境，验证了低氧可造成STBM自合体滋养细胞表面脱落上调的科学假设，为“应用外周循环STBM预测sPE发病及预后”提供了实验依据，对sPE防治具有重要的指导意义。2.应用免疫印迹和免疫组织化学的实验方法，发现sPE胎盘组织及低氧处理的正常妊娠胎盘组织RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKII蛋白表达水平显著上调，而RhoC变化无显著差异，提示RhoA、RhoB、ROCKI、ROCKII蛋白参与sPE发病时合体滋养细胞的病理变化及生物学功能的改变。3.应用Spearman等级相关分析，发现sPE胎盘组织及低氧处理的正常妊娠胎盘组织RhoB、ROCKI和ROCKII蛋白表达上调与STBM脱落上调呈正相关，进一步证明RhoB/ROCK信号分子与sPE发病的密切关联。

全文目录

英文缩写词表  4-6
Abstract  6-11
中文摘要  11-15
前言  15-17
第一部分重度子痫前期合体滋养细胞体视学参数与胎盘组织 Rho/ROCK分子表达的变化  17-39
  材料和方法  17-31
  结果  31-36
  讨论  36-38
  小结  38-39
第二部分低氧对胎盘合体滋养细胞微绒毛膜脱落与 Rho/ROCK 分子表达的影响  39-59
  材料和方法  39-41
  结果  41-57
  讨论  57-58
  小结  58-59
全文小结  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-66
文献综述合体滋养细胞微绒毛膜与子痫前期  66-71
  参考文献  69-71
研究生期间发表文章  71

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