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Activin A-Smads信号通路在子宫内膜异位症病理机制中的作用

作　者: 郑娟
导　师: 刘嘉茵; 崔毓桂
学　校: 南京医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子宫内膜异位症 ActivinA Smad 芳香化酶雌二醇
分类号: R711.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是一种常见的妇科疾病，但其病理生理机制仍不清楚，比较一致的观点：EMs是一种雌激素依赖性疾病。异位灶局部炎症和雌激素过多生成的分子机制逐步被揭示，即通过正反馈的机制，异位的子宫内膜间质细胞（ESCs）中类固醇合成限速酶（如芳香化酶P450arom）过表达，促进了雌激素持续分泌，又增加了异位组织中炎性因子如转化生长因子β（TGF-βs）和前列腺素E2（PGE2）的表达；后者又刺激类固醇合成限速酶——芳香化酶的增加。本课题组前期研究中，利用细胞因子蛋白质芯片的方法评估轻度（I/II期）EMs、重度（III/IV期）EMs患者和正常对照组腹腔液中的细胞因子差异表达，发现细胞因子激活素A（ActivinA）在EMs患者腹腔液中显著升高。ActivinA是高度保守的TGFβ家族的一员，能够激活Smads信号转导通路，发挥多种生物学功能。研究表明，内异症患者子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分泌的ActivinA分别是正常内膜的7和3倍；且在卵巢癌细胞系KGN细胞中，ActivinA通过与TGF-β I型受体ALK4结合促进芳香化酶的活性。由此我们假设，ActivinA可能能够通过ALK4、Smads信号转导通路促进内异症患者ESCs中芳香化酶的高表达，进而使异位灶局部雌激素合成异常升高，后者则引起异位子宫内膜组织的生物学行为的改变。研究目的：本文研究目的：(1)观察ActivinA对子宫内膜异位症患者ESCs细胞生物活性的影响；（2）通过上调或下调ActivinA及其受体以及细胞内Smad蛋白的表达水平，观察EMs间质细胞中P450arom表达、活性的变化；（3）研究Activin A-Smads信号通路在调节ESCs雌激素合成机制中的作用；（4）本项研究，进一步完善EMs发生的雌激素依赖学说，也为寻找EMs新的生物学治疗的靶点提供实验依据。材料和方法：（1）利用EMs患者在位内膜间质细胞体外培养模型，研究不同浓度(0,2.5,25,50ng/mL) Activin A处理不同时间（2h,12h,24h,48h,72h）对ESCs雌二醇（E2）分泌、细胞增殖、凋亡和细胞周期、以及细胞侵袭能力的影响。免疫电化学发光的方法检测E2浓度，MTT检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。(2)用Real-time PCR、Western blot的方法检测EMs患者在位和异位ESCs、以及正常人ESCs中P450arom的差异性表达。(3)培养EMs患者的在位内膜间质细胞，应用不同浓度的Activin A(0,2.5,25,50ng/mL)刺激ESCs不同时间（2h,12h,24h），检测P450arom mRNA和蛋白水平的变化；在培养液中加入雌激素生成底物睾酮，检测培养上清液中的E2的变化。(4)分别利用PKA抑制剂H89、Smad4-siRNA降调Smad4的表达、ALK4抑制剂SB431542处理ESCs，提取胞核和胞浆蛋白，检测p-Smad3的水平；免疫电化学发光的方法检测细胞上清液中E2浓度；Real-time PCR的方法检测P450arom mRNA水平的变化；Western blot、免疫荧光的方法检测芳香化酶、p-Smad3、Smad3、Smad4和Smad7的蛋白水平的变化。结果：（1）与对照组相比，25ng/ml Activin A处理ESCs24h和48h，均明显促进ESCs的E2生成（p<0.05）；但对ESCs增殖活性、凋亡及细胞周期均无显著影响（p均>0.05）；可促进ESCs高表达MMP-2和MMP-9（p<0.05）、低表达E-钙黏连蛋白（E-cadherin）（p<0.05）；使ESCs侵袭性增加（p<0.05）。（2）在正常、内异症患者在位及异位组织和间质细胞中，均表达P450arom；内异症患者在位和异位ESCs中的P450arom表达水平较正常细胞显著升高（p<0.01）。（3）25ng/ml Activin A处理内异症患者在位ESCs24h，P450arom mRNA和蛋白水平表达均显著增高（p<0.05），而正常ESCs对Activin A处理无明显反应。在培养的ESCs，加入睾酮作为E2合成的底物，可引起E2分泌增多（p<0.05），Activin A与之具有协同作用（p<0.05）。（4）加入H89抑制PKA后，Activin A引起的ESCs E2分泌量并无显著变化（p<0.05）；Activin A可以引起EMs患者ESCs中Smad3磷酸化，5min时即有反应，15min时达高峰，1h时略下降，Smad4和Smad7表现与此相似；在无Activin A刺激时，胞浆和胞核中p-Smad3的表达很微弱，而Activin A刺激后Smad3发生磷酸化，大部分的p-Smad3转位入核。Activin A对ESCs中E2分泌、P450arom表达、及Smad3磷酸化后核转位的效应都可被SB431542（抑制ALK4）和Smad4-siRNA（降调Smad4表达）所抑制（p<0.05）。结论：（1）、ActivinA可促进EMs患者ESCs雌激素分泌、增加其侵袭性，但对ESCs增殖活性、凋亡及细胞周期均无显著影响。提示细胞侵袭性增加等细胞生物学行为可能也与局部雌激素升高相关。（2）、EMs患者在位和异位ESCs中P450arom表达升高，且其表达和活性可在ActivinA作用下增强，支持了内异症是一种雌激素依赖性疾病的理论，而Activin A是局部雌激素升高的调节因子。（3）、ActivinA促进EMs患者在位ESCs P450arom表达增加、E2分泌增多，不依赖于PGE2-PKA信号通路的机制，提示Activin A可通过独立的信号转导通路参与EMs的发生发展。（4）、ActivinA可促进EMs患者在位ESCs中Smad3磷酸化，p-Smad3与Smad4形成复合物并发生核转位，启动了P450arom的转录。ALK4抑制剂SB431542或Smad4-RNAi下调Smad4均可使核内p-Smad3水平降低，P450arom表达减少，E2分泌下降。因此，Activin A通过不依赖于PGE2的独立的ALK4-Smads信号通路促进内异症患者ESCs雌激素分泌。（5）、Activin A促进ESCs高表达芳香化酶，形成局部高浓度E2微环境，是异位灶存活和发展的重要病理机制。这些研究有助于将来最终阐明EMs的病因和病理生理机制，也为探寻EMs新的生物学治疗方法积累了实验资料。

全文目录

中文摘要  5-8
ABSTRACT  8-12
前言  12-15
第一部分 ActivinA 对 ESCs 雌激素生成及细胞生物学行为的影响  15-30
  一、材料和方法  15-24
  二、结果  24-30
第二部分 ActivinA-Smads 信号通路对 ESCs 雌激素合成的调控  30-45
  一、材料和方法  30-36
  二、结果  36-45
讨论  45-52
总结  52-53
参考文献  53-61
综述  61-84
  参考文献  76-84
攻读学位期间发表文章情况  84-85
致谢  85

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