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糖耐康干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化研究

作　者: 吴丽丽
导　师: 刘铜华
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 糖尿病肾病糖耐康肾小管上皮转分化 TGF-β1/Smad信号通路作用机制实验研究
分类号: R692
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一,是糖尿病患者的主要死亡原因之一。近年来,DN已成为一个严重威胁人们生命健康的疾病,寻找预防和治疗DN的有效药物和治疗方法已成为世界范围的研究热点。肾小管上皮细胞转分化(tubular epithelial to mesenchymal transdifferentiation, TEMT)是肾间质纤维化发生和发展的重要机制之一。TEMT过程中TGF-β1/Smad信号转导途径起了重要作用。中医药在DN治疗方面积累了丰富的经验,特别是在治疗早期DN方面取得了较好的临床疗效,但是对中医药治疗DN的作用机制研究较少,有待于进一步深入研究。本论文首先对近年来中西医对DN的认识和防治进展进行了综述,拟在前期研究工作基础上,进一步从整体、组织、蛋白和基因分子水平探讨了中药复方糖耐康通过调节TGF-β1/Smad信号通路来抑制TEMT,以此来治疗DN的作用机制。1文献综述参照古今中医有关文献,对DN的中医病名、病因病机、辨证论治、临床及实验研究进行了概述,同时对DN肾小管上皮转分化研究所取得的进展进行了综述。2实验研究目的：紧紧围绕肾小管上皮细胞转分化机制中有待探索的热点问题TGF-β1/Samds信号转导途径与DN肾间质纤维化的关系,探讨临床有效中药“糖耐康”防治糖尿病肾间质纤维化的作用及机制,为其治疗DN提供实验依据。方法：50只2次随机血糖均大于13.9mmol/L的雄性KKAy小鼠,按随机血糖值随机分为5组：模型组、糖耐康高剂量组、糖耐康中剂量组、糖耐康低剂量组及缬沙坦组,每组10只；健康雄性C57BL／6J小鼠10只为正常组。糖耐康高、中、低剂量组分别以4.56g/kg.d,2.28g/kg.d,1.14g/kg.d浓度按0.01ml/g体重灌服糖耐康水溶液,缬沙坦组按0.46mg/kg.d灌服缬沙坦水溶液,正常组和模型组灌服等体积0.9%氯化钠溶液。每日1次,连续给药8周。记录小鼠一般情况、体重、血糖,实验周期结束时,测定小鼠血清血糖(glucose, Glu)、胰岛素(Insulin, INS)、甘油三酯(glyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和肌酐(serum creatinine, Scr)水平,做肾组织HE染色、Massom染色和PAS染色并进行图像分析；免疫组化法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)表达；Real-time PCR检测肾TGF-β1mRNA、TGF-βR1mRNA、TGF-βR2mRNA、Collagen I mRNA、Collagen III mRNA和FNmRNA表达；wetern blot检测肾TGF-β1、Smad2, P-smad2, Smad3, P-smad3, Smad7蛋白表达。实验数据用SPSS16.0进行统计学处理。结果：实验一：与同周龄正常组小鼠比较,模型组小鼠体质量显著增加(P<0.01),各给药组小鼠体质量较同期模型组有显著下降(P<0.05,P<0.01)；模型组与正常组比较,快速空腹血糖(fasting blood sugar,FBG)、TG、TC、INS显著升高(P<0.01),糖脂代谢紊乱；24h尿蛋白定量、肾质量升高(P<0.05),但是肾功能无差异(P>0.05)。20周龄模型组小鼠肾小球较正常组增大,细胞外膜基质增加,肾小管管腔扩大,蛋白管型明显,半定量分析肾组织病理损伤评分增加。实验二：病理学检测结果显示,与正常组比较,模型组小鼠肾间质纤维化评分和纤维化面积显著增大(P<0.01)；与模型组比较,各治疗组小鼠肾间质纤维化评分和纤维化面积显著减小(P<0.05)；免疫组化结果显示,模型组小鼠肾组织中a-SMA蛋白表达呈现较强阳性。与模型组比较,缬沙坦组、糖耐康低、中、高剂量组a-SMA蛋白表达显著减少(P<0.01)；模型组小鼠肾组织中E-cadherin蛋白表达弱阳性。与模型组比较,缬沙坦组、糖耐康低、中、高剂量组E-cadherin蛋白表达明显增加(P<0.01)；wstern blot结果显示,与正常组小鼠比较,KKAy小鼠肾脏组织TGF-β1蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,缬沙坦组、糖耐康低、中和高剂量组TGF-β1蛋白表达含量都明显降低(P<0.01),其中糖耐康高剂量组与缬沙坦组相比较,TGF-β1显著降低(P<0.01)。实验三：Real-time PCR结果显示,与正常组比较,KKay小鼠TGF-β1 mRNA. Collagen I mRNA、Collagen III mRNA和FNmRNA相对表达量显著升高(P<0.05), TGFβ-R1 mRNA和TGFβ-R2 mRNA无显著变化(P>0.05)；与模型组比较,缬沙坦组和糖耐康高剂量组TGF-β1 mRNA、Collagen III mRNA和FN mRNA的降低具有统计学意义(P<0.05)；western blot结果显示,与正常组小鼠比较,KKAy小鼠肾smad2蛋白、p-smad-2蛋白、smad-3蛋白、p-smad-3蛋白表达均显著升高(P<0.01),smad-7蛋白表达显著降低(P<0.01),与模型组比较,缬沙坦组、糖耐康各治疗组上述蛋白表达有不同的改变(P<0.05)。结论：1、中药糖耐康对自发性KKAy小鼠有显著的降糖和降脂作用,能减少尿蛋白量,降低DN肾脏病理损伤评分,抑制糖原等细胞外基质的沉积,改善早期肾脏病变,与缬沙坦疗效相当,且在降低体质量、肾重、FBG、血清INS和TC等方面优于缬沙坦,对DN有一定的保护作用；2、TEMT过程存在于KKAy小鼠肾组织,参与了DN肾纤维化,而缬沙坦和糖耐康具有一定的抑制TEMT的作用；3、糖耐康可干预TGF-β1/smads信号转导途径的多个位点,主要机制可能是增加smad7表达从而抑制TEMT过程,这可能是其治疗DN的重要靶点。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-9
英文縮略词表  9-10
第一部分文献综述  10-33
  综述一中医药防治糖尿病肾病研究进展  10-24
    参考文献  21-24
  综述二肾小管上皮细胞转分化在糖尿病肾病中的作用  24-33
    参考文献  29-33
第二部分实验研究  33-85
  前言  33-34
  实验一糖耐康对KKAy小鼠糖脂代谢及肾脏形态学的影响  34-50
    材料与方法  34-38
    结果  38-47
    小结  47-48
    参考文献  48-50
  实验二糖耐康对KKAy小鼠肾小管上皮细胞转分化的影响  50-66
    材料与方法  50-60
    结果  60-64
    小结  64-65
    参考文献  65-66
  实验三糖耐康通过TGF-β_1/Smad信号通路调节KKAy小鼠肾小管上皮转分化的作用机制  66-85
    材料与方法  66-71
    结果  71-81
    讨论  81-83
    参考文献  83-85
结语  85-87
致谢  87-88
个人简介  88-89
附图  89-90

糖耐康干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化研究

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