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丹酚酸B对肾小管上皮细胞转分化防治作用的研究

作　者: 姚刚
导　师: 杨俊伟
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 丹酚酸B 上皮细胞细胞转分化转化生长因子-β1 microRNA
分类号: R692
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肾小管上皮细胞－间充质细胞转分化是肾间质纤维化发生发展的核心环节。上皮细胞转分化在肾脏纤维化中的作用日益受到人们的重视，其原因是肾小管上皮细胞通过上皮细胞转分化演变为肌成纤维细胞导致肾纤维化的过程在恰当的干预下能够被逆转。MicroRNA（miRNA）是新近证明的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的长度约为22nt的小分子RNA，人类基因有近1/3受miRNA调控。研究已经表明，部分miRNA参与了肾间质纤维化的发生发展。丹酚酸B是丹参的主要水溶性成分之一，是丹参抗纤维化的有效成分。丹酚酸B是否同样具有抑制肾组织纤维化，尤其是否还具有阻止甚至逆转肾小管上皮细胞转分化的作用，机制如何，目前仍然不清。为此，我们进行了丹酚酸B对肾小管上皮细胞转分化防治作用的研究，希望通过本项工作可以明确丹酚酸B的临床价值，为防治肾组织纤维化寻求新的方法并提供理论和实验依据。目的1.明确丹酚酸B阻止肾小管上皮细胞转分化的作用2.明确丹酚酸B逆转肾小管上皮细胞转分化的作用3.探讨丹酚酸B逆转肾小管上皮细胞转分化时miRNA表达的变化及意义4.在体内进一步明确丹酚酸B防治肾间质纤维化的作用方法1.阻止肾小管上皮细胞转分化：体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞分为3组：①对照组：未加入丹酚酸B或者TGF-β1；②TGF-β1组：在细胞培养基中加入TGF-β1（浓度为5ng/ml）；③丹酚酸B＋TGF-β1组：在细胞培养基中分别加入丹酚酸B和TGF-β1(浓度为5ng/ml)，按丹酚酸B的浓度分为4个亚组：A组、B组、C组和D组，丹酚酸B的浓度分别为A组：0.1μmol/L，B组：1μmol/L，C组：10μmol/L，D组：100μmol/L。72h后，采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色检测细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-cadherin的表达情况。2.逆转肾小管上皮细胞转分化：体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞分为3组：1.对照组：未加入丹酚酸B或者TGF-β1；TGF-β1组：在细胞培养基中加入TGF-β1（浓度为5ng/ml）；丹酚酸B逆转组：在细胞培养基中先加入TGF-β1(浓度为5ng/ml)，72h后HK-2细胞成功诱导EMT后形成的间充质细胞，再更换为TGF-β1（浓度为5ng/ml）和丹酚酸B继续培养72h，按丹酚酸B的浓度分为4个亚组：A组、B组、C组和D组，丹酚酸B的浓度分别为A组：0.1μmol/L，B组：1μmol/L，C组：10μmol/L，D组：100μmol/L。采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学染色检测细胞α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-cadherin的表达情况。3.逆转肾小管上皮细胞转分化时miRNA表达：体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞分为3组：①对照组：未加入丹酚酸B或者TGF-β1；②TGF-β1组：在细胞培养基中加入TGF-β1；③丹酚酸B逆转组：在细胞培养基中先TGF-β1，48h后HK-2细胞成功诱导EMT后形成的间充质细胞，再更换为TGF-β1和丹酚酸B继续培养72h，采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；免疫细胞化学染色检测细胞E-cadherin的表达情况；miRNA芯片检测各组细胞miRNA的表达变化。4.体内实验：雄性SD大鼠，建立单侧输尿管梗阻模型（UUO），设：①假手术组（n=8）；②模型组（n=8），行左侧输尿管结扎术，无菌生理盐水灌胃，每天1次；③治疗组（n=8），丹酚酸B30mg/kg/d，无菌生理盐水配置灌胃，每天1次。术后第9d处死各组大鼠。采用光镜观察肾间质纤维化、炎细胞浸润，免疫组化观察肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Vimentin蛋白表达的变化。结果1.阻止肾小管上皮细胞转分化：TGF-β1组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态；胞浆内大量表达α-SMA，同时E-cadherin的表达明显减少；不同剂量丹酚酸B治疗可减轻TGF-β1诱导的细胞形态学改变和胞浆内α-SMA的表达，同时E-cadherin的表达得到明显恢复，且呈剂量依赖性。2.逆转肾小管上皮细胞转分化：TGF-β1组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态；胞浆内大量表达α-SMA，同时E-cadherin的表达明显减少；在HK-2细胞成功诱导EMT并形成间充质细胞后，再分别加入不同浓度的丹酚酸B继续培养72h，无论在基因水平还是在蛋白水平，不同剂量丹酚酸B治疗仍可减轻TGF-β1诱导的细胞形态学改变和胞浆内α-SMA的表达，同时E-cadherin的表达得到明显恢复，表明丹酚酸B能够有效逆转TGF-β1诱导的HK-2细胞的EMT。3.逆转肾小管上皮细胞转分化时miRNA表达分析：①与正常HK-2细胞比较，TGF-β1组有72种miRNA的表达出现显著改变，其中43种表达下调2倍以上，29种表达上调2倍以上。②与TGF-β1组比较，丹酚酸B逆转组，有47种miRNA的表达出现显著改变，其中27种表达下调2倍以上，20种表达上调2倍以上。③有9种miRNA表达在两组同时出现显著改变，其中7种在TGF-β1组明显下调，而在丹酚酸B逆转组明显上调，2种在TGF-β1组明显上调，而在丹酚酸B逆转组则明显上调，miRNA的靶基因主要与TβR I和锌指蛋白密切相关。4.体内实验：①治疗组大鼠肾间质纤维化程度较模型组明显减轻。②UUO模型第9d时大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA和Vimentin表达明显增强，炎细胞浸润明显增加。③采用丹酚酸B治疗后，肾组织TGF-β1、α-SMA和Vimentin表达的异常增强能得到有效抑制，炎细胞浸润明显减少。结论丹酚酸B具有防治肾间质纤维化的作用，而这一作用与其能有效阻止，尤其是逆转肾小管上皮细胞转分化有关。丹酚酸B逆转肾小管上皮细胞转分化时伴有明显miRNAs表达变化，部分miRNA表达与丹酚酸B逆转肾小管上皮细胞转分化密切相关。

全文目录

中文摘要  4-8
Abstract  8-12
前言  12-16
第一部分  16-28
  1 材料与方法  17-20
  2 结果  20-24
  3. 讨论  24-26
  参考文献  26-28
第二部分  28-42
  1 材料与方法  30-33
  2 结果  33-36
  3 讨论  36-37
  4 结论  37-38
  参考资料  38-42
第三部分  42-55
  1 材料与方法  44-46
  2 结果  46-51
  3 讨论  51-52
  4 结论  52-53
  参考文献  53-55
第四部分  55-66
  1 材料  56-57
  2 方法  57-58
  3 结果  58-62
  4 讨论  62-63
  5 结论  63-64
  参考文献  64-66
综述一  66-79
  参考文献  72-79
综述二  79-93
  参考文献  89-93
综述三  93-108
  参考文献  103-108
附录  108-124
攻读学位期间发表文章情况  124
已经投稿的论文  124-125
致谢  125

丹酚酸B对肾小管上皮细胞转分化防治作用的研究

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