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miR-183在人骨肉瘤细胞系中的表达及其对骨肉瘤转移能力影响的初步实验研究

作　者: 赵海恩
导　师: 范清宇; 裘秀春
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 骨肉瘤 microRNA-183Ezrin 蛋白迁移侵袭失巢凋亡现象
分类号: R738.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：骨肉瘤是青少年中最常见的原发于骨的的恶性肿瘤，骨肉瘤具有很高的全身转移的倾向，大约20%的患者在初次诊断的时候已经发生肺转移，另外还有40%的患者晚期发生远处器官的转移。随着化疗药物的出现和应用，目前骨肉瘤患者的5年生存率已由上世纪70年代之前的10-20%上升至现在的60-80%。但是无论是原发性骨肉瘤还是转移性骨肉瘤，对常规的化疗药物都具有耐药性，肿瘤耐药是骨肉瘤患者保肢手术治疗失败及发生转移的主要原因，而肿瘤发生转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。转移性肿瘤对治疗不敏感的主要原因是药物抵抗。研究发现，发生肺转移的骨肉瘤细胞表现出了和原发性肿瘤细胞完全不同的生物学特性，发生转移后的肿瘤细胞群在细胞的倍增速度、酶表达谱、染色体组型和化疗药物的敏感性方面都不同于其原发的肿瘤细胞群。这就解释清楚了对原发肿瘤有效的化疗方案，为什么却对转移性肿瘤丝毫不起作用。恶性肿瘤最后在人体内形成转移病灶需要经过很多重要的步骤。要能够从分子水平上控制肿瘤的转移，首先需要对肿瘤的转移机制有彻底的认识，通过控制肿瘤转移的各个步骤，进而防止肿瘤发生转移。尽管经过的大量的基础研究和临床试验，骨肉瘤的转移机制仍然不是很清楚。对骨肉瘤转移的生物学机制进行彻底研究将会为治疗骨肉瘤提供革命性的理论基础。microRNA作为基因的一种表现形式，是否在骨肉瘤发生转移的过程中发挥作用以及以何种形式发挥作用，引起了学者的关注。因此，本实验旨在通过比较高、低不同转移能力的骨肉瘤细胞中microRNA的表达水平的差异，并通过瞬时转染microRNA的方法对细胞进行干预，观察干预后肿瘤细胞的生长及转移特性，以探索瞬时转染microRNA对骨肉瘤细胞生物学性质的即刻效应，为更好的明确骨肉瘤的转移机制提供理论依据和实验指导。研究方法：首先比较高、低转移能力骨肉瘤细胞中miR-183及Ezrin蛋白的表达差异，根据表达水平的差别对骨肉瘤细胞转染外源性miR-183，建立不同表达水平miR-183的骨肉瘤细胞模型。然后采用MTT、流式细胞仪、细胞划痕实验、transwell实验、免疫细胞化学、westernbloting等实验方法对细胞的生长特性和形态学表现进行研究，以评估miR-183在不同转移能力细胞中的表达，miR-183对细胞蛋白表达水平的影响和细胞转移能力的影响。最后通过相关的统计学分析，以明确miR-183表达水平与Ezrin蛋白的表达量、肿瘤的侵袭和转移能力之间的相关性。研究结果：1.无论是在骨肉瘤细胞还是在骨肉瘤组织中，高转移性骨肉瘤中Ezrin蛋白的表达量高于低转移性骨肉瘤中的表达；而实时定量PCR研究发现，高转移性骨肉瘤细胞中miR-183的表达量显著低于高转移性细胞中的表达量。2.通过瞬时转染外源性miR-183可以使高转移性骨肉瘤细胞F5M2中miR-183的表达量显著升高，成功建立不同表达水平miR-183的骨肉瘤细胞模型。3.MTT、流式细胞仪、细胞划痕实验、transwell等实验结果表明外源性过表达miR-183的F5M2细胞转移能力显著下降，呈剂量依赖关系；miR-183对F5M2细胞的增殖和凋亡能力无影响。4.免疫细胞化学、westernbloting等实验结果表明外源性过表达miR-183的F5M2细胞中Ezrin蛋白的表达量下降，呈剂量依赖关系。结论：高转移性骨肉瘤细胞F5M2中miR-183的表达量较低转移性骨肉瘤F4中表达量较低，而高转移性肿瘤中Ezrin蛋白的表达量显著高于低转移性肿瘤。通过转染外源性miR-183可以显著提高miR-183在F5M2的表达量，降低Ezrin蛋白表达。miR-183的表达量提高不仅会使F5M2中Ezrin蛋白的表达量降低，而且可以使肿瘤的侵袭和迁移能力显著抑制，而增殖和凋亡特性无明显变化。相关性研究发现，Ezrin蛋白的表达量和骨肉瘤细胞的转移潜能存在正相关。这些研究结果提示通过提高miR-183在高转移性骨肉瘤F5M2中的表达量，可以抑制Ezrin蛋白的表达，从而抑制肿瘤转移潜能。miR-183抑制骨肉瘤转移的这一机制还有待于进一步的实验验证，且为深入的基础研究和潜在的临床应用开辟了新途径。

miR-183在人骨肉瘤细胞系中的表达及其对骨肉瘤转移能力影响的初步实验研究

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