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靶向沉默蛋白激酶Polo-like Kinase 1治疗骨肉瘤的实验研究

作　者: 刘先哲
导　师: 杨述华
学　校: 华中科技大学
专　业: 骨科学
关键词: 骨肉瘤蛋白激酶PLK1 短发卡RNA BI2536
分类号: R738.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

骨肉瘤是一种常见于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤,其恶性程度高,发展迅速。骨肉瘤多发生于骨端,偶发于骨骺或骨干。其治疗方法包括外科手术切除及新辅助化疗。相比单纯手术治疗,新辅助化疗联合手术治疗可将骨肉瘤患者生存率由11%提高到60-70%。已接受一线化疗药物治疗的晚期骨肉瘤患者常需要追加多个疗程化疗,因此化疗药物的毒性作用更加明显。经过系统治疗后许多患者肿瘤仍会复发,一旦复发其生存时间将大大缩短。很不幸的,过去20年人类在治疗骨肉瘤领域没有取得长足的进步,患者生存率未得到明显提高。因此,发现新的治疗骨肉瘤的生物靶点是未来制定个性化治疗方案的重要一环。在该项研究中,我们在骨肉瘤细胞系(KHOS和U20S)中使用慢病毒短发卡RNA库(lentiviral short hairpin RNA)系统的筛选人类已知的激酶组。当慢病毒shRNA被转导入骨肉瘤细胞系后,我们发现许多蛋白激酶,包括丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Polo样激酶1(PLK1)的基因表达被沉默,骨肉瘤细胞的生长受到抑制并逐渐发生细胞凋亡。互补脱氧核糖核酸挽救实验(cDNA rescue assay)和合成小干扰核糖核酸转染实验证实骨肉瘤细胞系表型发生变化的原因为PLK1基因表达的缺失。Western blotting蛋白免疫印迹实验同样也显示蛋白激酶PLK1在各种不同骨肉瘤细胞系以及手术切除的骨肉瘤组织标本中被广泛激活并且大量表达。蛋白激酶PLK1的小分子抑制物BI 2536能够在二维和三位培养系统抑制骨肉瘤细胞KHOS和U20S的增殖并诱发细胞凋亡。通过在二维和三维培养系统进行细胞增殖实验,我们证实BI 2536可以抑制骨肉瘤细胞生长。使用一定浓度BI 2536处理细胞后,细胞周期发生明显变化,大部分细胞停滞于G2/M期。免疫荧光和Western blotting蛋白免疫印迹实验显示BI 2536能明显抑制PLK1和诱导髓样细胞白血病分化蛋白1(Mc1-1)的表达,且抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性。另外,检测出凋亡相关蛋白PARP及其裂解物的表达和水解酶实验进一步证实BI 2536能够诱发细胞凋亡。最后构建骨肉瘤动物模型,我们发现接受BI 2536治疗的小鼠,其骨肉瘤体积明显小于对照组。通过收集良好随访的骨肉瘤患者肿瘤组织,我们制作了肿瘤组织微阵列并使用免疫组织化学的方法对不同组织中的PLK1蛋白进行标记染色。PLK1表达水平高的患者其总体生存率和生存时间要明显低于表达水平低的患者。上述结果显示采用高通量筛选技术筛选人类激酶组对于发现治疗肿瘤的潜在靶向药物有极大帮助,其可行性和有效性已得到证实。上述发现为以蛋白激酶PLK1为潜在靶点治疗骨肉瘤提供了有力支持。

全文目录

前言  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一部分慢病毒短发卡RNA库筛选人类激酶组发现蛋白激酶Polo-likekinase 1 是治疗骨肉瘤的潜在靶点  12-46
  一研究对象  12
  二主要试剂与仪器  12-13
  三试验方法与步骤  13-24
  四统计学分析  24
  五结果  24-28
  六讨论  28-30
  图表  30-46
第二部分抑制蛋白激酶Polo-like kinase 1表达可阻碍骨肉瘤细胞在体外和体内的生长  46-79
  一研究对象  46
  二主要试剂与仪器  46-47
  三试验方法与步骤  47-54
  四统计学分析  54
  五结果  54-57
  六讨论  57-59
  图表  59-79
参考文献  79-86
缩略词表  86-87
攻读博士期间发表的论文  87-88
攻读博士期间参加的会议  88
攻读博士期间参与编写的专著  88
攻读博士期间获得的奖励  88-89
致谢  89

靶向沉默蛋白激酶Polo-like Kinase 1治疗骨肉瘤的实验研究

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