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靶向mTORC1与mTORC2信号抑制骨肉瘤的实验研究

作　者: 王小开
导　师: 金大地; 白晓春
学　校: 南方医科大学
专　业: 骨科学
关键词: 骨肉瘤哺乳动物Rapamycin靶点信号转导肿瘤靶向治疗
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景：人骨肉瘤(HOS)是青少年时期最易发生的恶性肿瘤之一,其发生和发展的特点是易于转移以及原位复发。治疗骨肉瘤通常需要多种手段同时进行,包括手术切除,放疗以及药物化疗。在接受单独手术治疗的患者中,约有20%的病人因为肿瘤远处转移而仅仅获得较低的2年生存率。因此手术切除肿瘤合并术前以及术后的放疗合并化疗显得尤为重要。目前常用的化疗药物有顺铂(Cisplatin)甲氨蝶呤,环磷酰胺等。虽然辅助化疗药物在一定程度上抑制了肿瘤的生长与转移,但不能忽略的是病人对其副作用的耐受程度以及全身系统性的毒性反应。基于细胞内信号通路的分子靶向治疗肿瘤是目前对于新型抗肿瘤药物研究的热点。通过阻断肿瘤细胞的能量代谢通路或是激活肿瘤细胞的凋亡通路均可以抑制肿瘤细胞的发生与发展。哺乳动物Rapamycin靶标(mTOR)是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在细胞中以复合物形式存在。mTOR与Raptor、mLst8、FKBP38、Deptor和PRAS40构成了mTORC1。mTORC1对雷帕霉素(Rapamycin)敏感,能磷酸化S6激酶1(p70S6K1)和真核生物起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1),促进蛋白质翻译。mTOR与Rictor、mLst8、mSin1、Deptor和Protor形成了mTORC2。mTORC2对Rapamycin不敏感,可以磷酸化Akt (S473)。这两种复合物通过接受营养、氧气、能量和生长因子等细胞内外信号,调控蛋白翻译、代谢、细胞生长增殖、存活和自噬等多种生理过程。超过50%的恶性肿瘤存在mTOR信号通路的过度激活,因而mTOR是重要的癌症药物治疗靶标。第一代mTOR抑制剂Rapamycin及其类似物能抑制癌细胞的增殖,但它们仅在少数癌症的治疗中取得较好疗效,如细胞淋巴瘤,肾癌和子宫内膜癌,多数肿瘤病人对Rapamycin不敏感。引起Rapamycin抵抗的主要原因是：1)Rapamycin不能完全抑制mTORC1,虽然p70S6K1被强烈抑制,但是4E-BP1和mRNA的翻译却对Rapamycin不敏感；2)不能抑制mTORC2的活性；3)存在mTORC1和Akt之间的负反馈通路。Rapamycin类似物可以通过S6K1和胰岛素受体底物(IRS-1)使Akt活性升高,进而促进细胞存活。最近开发的第二代mTOR抑制剂是针对mTOR激酶结构域的ATP-竞争性抑制剂,不但可抑制mTORC1,也可抑制mTORC2与Akt的负反馈活性。体内外实验研究证明这类药物有很好的抑制多种肿瘤效果,部分mTORC1/2抑制剂正处于临床试验阶段。阐明mTORC1/2抑制剂对各种癌症的治疗作用及其抑制肿瘤的细胞与分子生物学机制可为这些药物的临床应用提供理论基础和指导。此外,最新的癌症生物学研究表明,mTORC2在一些癌症的发生与进展中起重要作用,mTORC2将成为一种很有前景的肿瘤治疗靶标分阐明mTORC2在各种肿瘤发生与进展中的作用,探讨靶向mTORC2对这些肿瘤的抑制作用及其细胞与分子生物学机制可为靶向mTORC2的癌症治疗提供理论依据。目的：mTORC2在骨肉瘤发生进展中的作用不清楚,同时靶向mTORC1与mTORC2对骨肉瘤的影响及其细胞与分子机制尚未有研究。本课题通过使用mTORC1特抑制剂]Rapamycin与mTORC1/2双抑制剂PP242,以及转染小干扰RNA(siRNA)分别敲低Raptor (mTORC1)、mTOR(mTORC1/2)或Rictor (mTORC2),观察比较抑制mTORC1与(或)mTORC2信号通路对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡的影响。并且联合使用传统化疗药物顺铂(Cisplatin),比较靶向mTORC1与(或)mTORC2与Cisplatin是否产生协同效应。本研究为特异靶向mTORC2或同时靶向mTORC1/2(第二代mTOR抑制剂)治疗骨肉瘤提供临床前实验证据。方法：使用mTORC1特异抑制剂Rapamycin与第二代mTORC1/2抑制剂PP242处理三种骨肉瘤细胞(MG63/U2OS/Saos-2),观察mTOR信号通路活性以及这些细胞增殖、迁移和凋亡的变化。三种细胞对于mTOR信号通路抑制剂的敏感性使用1C50检测。药物抗增殖能力使用抑制率实验、克隆形成实验以及细胞周期实验进行检测。抗迁移能力使用划痕试验检测。对其诱导凋亡的能力使用碘化吡啶(P1)染色实验与凋亡蛋白免疫印迹实验(western-blot)检测。同时,联合使用PP242与传统化疗药物Cisplatin,观察两种药物对于骨肉瘤细胞的增殖与凋亡是否具有协同效应。通过转染小干扰RNA (siRNA)分别敲低Raptor (mTORC1)、mTOR(mTORC1/2)或Rictor (mTORC2),观察比较抑制mTORC1与(或)mTORC2信号通路对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡的影响,以及联合使用Cisplatin的协同效应。结果：1. mTORC1/2双抑制剂PP242能够有效抑制骨肉瘤细胞增殖在骨肉瘤细胞MG63、U2OS、Saos-2中,使用mTORC1/2的抑制剂PP242可剂量依赖地抑制mTORC2下游底物分子Akt (S473)的磷酸化,而Rapamycin因负反馈调节引起Akt (S473)磷酸化水平的升高。这些结果表明,mTOR激酶抑制剂能有效的抑制mTORC1和mTORC2,但Rapamycin只能抑制mTORC1并且在一定程度上负反馈增强Akt (S473)的磷酸化。从而导致mTOR信号通路抑制效果减弱。我们进一步检测了PP242对三种骨肉瘤细胞系中的增殖抑制效果(P<0.05)。 CKK-8与隆形成实验均发现靶向mTORC1和mTORC1/2能有效抑制乳腺癌细胞的生长与增殖(P<0.05)。并且抑制mTORC1/2能够获得更好的抑制骨肉瘤细胞增殖的效果(P<0.05)。2.靶向mTORC2或者mTORC1/2可抑制骨肉瘤细胞的迁移我们通过划痕实验研究了mTORC1和rnTORC2在骨肉瘤细胞迁移中的不同作用。PP242或转染1nTOR、rictor siRNA比Rapamycin或转染raptor siRNA能更显著地Saos-2细胞的迁移(P<0.05)。这些结果进一步证实了mTORC2在骨肉瘤细胞迁移中的关键作用。3.靶向1mTORC2或是mTORCl/2相对于靶向mTORCl能够更加有效地促进骨肉瘤细胞凋亡mTOR信号通路下游激酶Akt是促进细胞存活的关键信号通路,其磷酸化水平反应了细胞生存通路的激活程度。我们发现,Rapamycin在三种骨肉瘤细胞中通过负反馈通路激活Akt从而并没有明显地促进骨肉瘤细胞凋亡的效果,而mTOR激酶抑制剂PP242能减少其磷酸化水平从而抑制mTORC2与Akt的活性。因此这些药物能增强活化状态的多聚腺苷二磷酸-核糖-多聚酶(cleaved-PARP)的表达并能显著促进血清饥饿状态下骨肉瘤细胞凋亡(P<0.05)。通过siRNA进行内源性干扰的研究发现,Saos-2细胞中敲低raptor、mTOR和rictor表达后可明显降低S6(S235／236)和／或Akt (S473)的磷酸化,敲低rictor和mTOR能促进cleaved-PARP的表达和增加血清饥饿诱导的细胞凋亡(P<0.05)。因此,mTORC2可能是骨肉瘤细胞中凋亡的关键分子靶点。4.在骨肉瘤细胞中抑制mTORCl/2能增强顺铂对于骨肉瘤细胞的抗增殖和促凋亡作用。顺铂作为骨肉瘤细胞常规化疗药物之一,在临床以及基础研究中均被证明能够抑制骨肉瘤细胞的发生与发展。通过比较mTORC1/2双抑制PP242与mTORC1抑制剂Rapamycin发现,PP242在骨肉瘤的增殖和凋亡方面能够与顺铂发生协同效应,从而获得更好抗增殖和促凋亡的效果(P<0.05)。进一步使用siRNA进行mTOR,Rictor以及Raptor干扰并联合顺铂的研究进一步验证了这一结果。因此,抑制mTORC1/2具有增强顺铂对骨肉瘤细胞的抑制作用。所有实验数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,结果表示为均数±标准差。P>0.05总体方差齐使用LSD法比较组间差异,总体方差不齐使用Dunnett法比较组间差异。结果P<0.05则结果具有显著性差异。结论：1.PP242药物靶向抑制mTORC1/2信号通路能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移,并且诱导其凋亡。在与Cisplatin联合作用时,并且在抗迁移和诱导凋亡方面相比于mTOR单抑制剂有更好的效果。2.特异性敲低mTORC2可以抑制骨肉瘤细胞的迁移以及诱导骨肉瘤细胞凋亡,阐明mTORC2是骨肉瘤细胞迁移与增殖的关键信号通路。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-12
前言  12-17
第一部分药物抑制mTOR信号通路对骨肉瘤细胞的影响  17-41
  1 材料  17-18
  2 实验方法  18-26
  3 实验结果  26-38
  4 讨论  38-41
第二部分基因敲低mTOR复合物配体对骨肉瘤的影响  41-54
  1 材料  41-42
  2 实验方法  42-47
  3 实验结果  47-52
  4 讨论  52-54
全文主要结论  54-55
参考文献  55-59
附录  59-60
攻读学位期间成果  60-61
致谢  61-63
统计学审稿证明  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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