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椎体成形术骨水泥渗漏对椎间盘退变的影响及作用机制的实验研究

作　者: 毛海青
导　师: 杨惠林
学　校: 苏州大学
专　业: 骨科学
关键词: 髓核细胞 CPC颗粒 PMMA颗粒细胞活性细胞周期凋亡衰老细胞外基质基因表达椎间盘退变
分类号: R687.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：探讨骨水泥颗粒对人髓核细胞生物学行为的影响。方法：用不同浓度的磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement， CPC）颗粒和两种聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（polymethylmethacrylate，PMMA）颗粒（PMMA1直径1-10μm和PMMA2直径0.3-0.4μm）处理人髓核细胞（human nucleus pulposus cells，HNPCs），观察在不同时间点骨水泥颗粒对HNPC细胞活性、细胞周期、凋亡和衰老的影响。结果：CPC颗粒处理对HNPC生物学行为无显著影响，PMMA颗粒在低浓度0.001，0.01%v/v时对HNPC细胞活性未产生显著影响，当浓度达到0.1%v/v以上时，能明显抑制髓核细胞的增殖活性（P<0.05）。PMMA1颗粒处理3.0d和6.0d，PMMA2颗粒处理6.0d时，骨水泥颗粒对HNPC细胞增殖的抑制效应随颗粒浓度的增加而逐渐增强；当PMMA1颗粒浓度为0.1、0.5和1.0%v/v时，PMMA2颗粒浓度为1.0%v/v时，PMMA颗粒对HNPC细胞的抑制增殖效果随着时间的延长逐渐加强（P<0.01）。当浓度0.5和1.0%v/v时，PMMA1颗粒比PMMA2颗粒对HNPC细胞活性有更强的抑制作用（P<0.05）。当浓度为0.01%v/v以上，PMMA颗粒作用导致HNPC G0/G1期细胞数量明显增加（P<0.05）。PMMA1颗粒处理1.0、3.0和6.0d，PMMA2颗粒处理6.0d时，在同一时间点HNPC G0/G1期细胞的比例随颗粒浓度的增加而逐渐增高；当PMMA颗粒浓度为0.5和1.0%v/v时，PMMA颗粒对HNPC细胞G0/G1期阻滞率随时间的延长而增高（P<0.01）。与空白对照组相比，0.5和1.0%v/v PMMA1颗粒处理6.0d后HNPC细胞中坏死细胞和凋亡细胞的比例明显增高（P<0.01），细胞衰老β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞数量明显增加（P<0.01），Western-blot结果显示HNPC细胞内p16INK4A表达显著增高。结论：CPC颗粒在体外对髓核细胞活性和细胞周期没有显著影响，而一定浓度的PMMA颗粒作用一定时间后，对髓核细胞活性和细胞周期产生显著影响，导致细胞数量减少，细胞被阻滞于G0/G1期，并且该效应具有时间依赖性和剂量依赖性。PMMA1颗粒比PMMA2颗粒对髓核细胞活性有更强的抑制作用。进一步研究表明，PMMA1颗粒能够促进髓核细胞的坏死和凋亡，诱导髓核细胞衰老。目的：探讨骨水泥颗粒处理后人髓核细胞基因表达变化。方法：用浓度为1%v/v的CPC和PMMA骨水泥颗粒处理HNPC，在不同时间点用实时荧光定量PCR检测HNPC中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）结构相关基因、促进ECM合成代谢基因和促进ECM分解代谢基因的表达水平。结果：CPC颗粒可以上调aggrecan（ACAN）、Ⅰ型胶原（COL1A1）和Ⅱ型胶原（COL2A1）的表达，分别为作用前的3.2倍、2.05倍和2.56倍；PMMA颗粒能上调Ⅰ型胶原（COL1A1）和Ⅱ型胶原（COL2A1）的表达，分别为作用前的3.15倍和3.71倍，但对aggrecan（ACAN）的表达无显著影响。CPC颗粒能够上调HNPC中编码骨形态发生蛋白基因（BMP2和BMP7）的表达（分别比作用前增加3.17倍和2.39倍），也能够增加转录因子SOX9基因的表达（2.81倍）和金属蛋白酶组织抑制物（TIMP1和TIMP2）基因的表达（分别为2.47和3.38倍）；PMMA颗粒作用后HNPC中BMP2、BMP7和SOX9基因表达均没有明显增加，但TIMP1和TIMP2表达上调（分别增加3.33和3.36倍）。CPC和PMMA骨水泥颗粒均可以使HNPC中基质金属蛋白酶3、7、9和13基因（MMP3、MMP7、MMP9和MMP13）的表达上调。其中，CPC颗粒处理后四种基质金属蛋白酶基因的表达分别比作用前增加3.8、2.68、3.39和3.15倍；PMMA颗粒处理后分别增加2.9、3.81、2.97和3.81倍。CPC颗粒使IL1A、IL1B和TNF基因表达分别增加2.97、4.44和2.8倍，PMMA颗粒使IL1B和TNF基因表达分别增加2.18和3.08倍。大部分基因表达高峰出现在骨水泥颗粒处理后1.0d和3.0d，但CPC颗粒处理的SOX9、TIMP1和TNF基因表达的高峰出现在处理后6.0d。结论：骨水泥颗粒对髓核细胞ECM结构相关基因的表达和ECM代谢相关基因的表达均产生显著的影响，PMMA颗粒可能比CPC颗粒具有更强的促进ECM分解代谢的作用。骨水泥颗粒处理使ECM相关基因的表达出现非同步改变，可能导致原有的ECM代谢的动态平衡难以维持。目的：探讨骨水泥颗粒注射诱导兔腰椎间盘退变的速度、程度和免疫组化改变。方法：选用60只新西兰大白兔，随机分成空白对照组、退变对照组、假手术组、PMMA组和CPC组。退变对照组用16G穿刺纤维环，假手术组用26G针穿刺，PMMA组和CPC组分别用浓度为1%v/v的CPC和PMMA颗粒混悬液通过26G针注入兔腰椎间盘。对不同时间点的动物进行影像学检查，组织学检查，免疫组化分析和TUNEL法检测凋亡细胞。结果：X线检查结果显示，PMMA组术后3周椎间隙较术前明显狭窄（P<0.01），并持续加重至术后12周（P<0.01），椎间盘高度下降的程度在术后各时间点均高于假手术组（P<0.01），但低于退变对照组（P<0.01）。CPC组与假手术组对比无显著差异（P>0.05）。MRI检查结果显示各组间Thompson评分存在显著差异（P<0.01）。术后6周和12周时PMMA组评分高于假手术组（P<0.005）。CPC组评分与假手术组没有显著差异，PMMA组和退变对照组没有显著差异。组织学评分结果显示，各组间组织学评分存在显著差异（P<0.01）。在术后各时间点，空白对照组与退变对照组组织学评分具有显著差异，PMMA组退变程度高于假手术组和CPC组，CPC组退变程度低于退变对照组（P<0.005）。PMMA组与退变对照组比较无显著差异，CPC组与假手术组比较无显著差异。II型胶原免疫组化检测发现，空白对照组、假手术组和CPC组髓核组织ECM呈强阳性染色，平均光密度值与退变对照组、PMMA组在不同时间点均有显著差异（P<0.05）。MMP7免疫组化结果发现，空白对照组、假手术组和CPC组的标本MMP7免疫阳性细胞数量较低，与退变对照组和PMMA组标本在各时间点阳性细胞率有显著差异（P<0.05）。退变对照组和PMMA组术后3周和6周的阳性细胞率的逐渐增高，至12周时阳性细胞的比例明显下降（P<0.05）。TUNEL法检测凋亡细胞结果示退变对照组和PMMA组在各时间点的细胞凋亡率与空白对照组，假手术组和CPC组均有显著差异（P<0.01）。退变对照组和PMMA组在均在6周时凋亡率达到顶峰，至12周时明显减少（P<0.05）。结论：PMMA颗粒注射使髓核内Ⅱ型胶原合成减少，MMP7表达增加，并且能够诱导髓核细胞凋亡，从而引起椎间盘退变。影像学表现为椎间隙高度降低，椎间盘磁共振信号改变。PMMA颗粒引起的椎间盘退变与经典的椎间盘退变模型相比速度较慢、程度较轻，同样浓度和剂量的CPC颗粒注射对椎间盘退变的影响不显著。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-14
引言  14-20
  参考文献  16-20
第一部分骨水泥颗粒对人髓核细胞生物学行为的影响  20-53
  材料和方法  20-27
  结果  27-44
  讨论  44-48
  小结  48
  参考文献  48-53
第二部分骨水泥颗粒处理后人髓核细胞基因表达变化  53-83
  材料和方法  54-59
  结果  59-73
  讨论  73-77
  小结  77
  参考文献  77-83
第三部分骨水泥颗粒诱导兔腰椎间盘退变的体内研究  83-110
  材料和方法  84-90
  结果  90-103
  讨论  103-106
  小结  106
  参考文献  106-110
结论  110-111
综述一椎体成形术骨水泥渗漏的研究进展  111-125
  参考文献  119-125
综述二椎间盘退变的机制研究和实验性治疗进展  125-161
  参考文献  145-161
英文缩略词表  161-163
攻读学位期间公开发表的论文  163-164
致谢  164-165

椎体成形术骨水泥渗漏对椎间盘退变的影响及作用机制的实验研究

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