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关于人皮肤真皮和角质上皮细胞以及在体创伤模型的研究

作　者: 郭爱华
导　师: 柳大烈
学　校: 南方医科大学
专　业: 整形外科学
关键词: 角质上皮细胞干细胞/祖细胞皮肤外植体成纤维细胞电场人皮肤创伤愈合模型
分类号: R641
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

长久以来,创伤愈合一直是困扰医学界的一个永恒的主题。对每天都要处理诸如皮肤缺损,大面积烧伤,以及闭合伤口等相关问题的整形外科医生来说,理解并促进创伤愈合的过程尤为重要。创伤愈合是一个需要多种类型细胞参与的复杂过程,包括炎症发生,伤口重新上皮化,创区新生组织形成,以及再生的组织结构重塑,这些过程按照一定的空间和时间的顺序有条不紊地进行。其中,真皮成纤维细胞和表皮角质上皮细胞是创伤愈合过程中的主要功能细胞。成纤维细胞在信号的引导下,向伤口迁移,分泌细胞外基质,进行胶原排列,并收缩伤口,促进愈合。上述细胞的非正常运动可以导致伤口延迟愈合甚至愈合失败,或者伤口愈合后出现增殖性瘢痕。因此,控制创伤愈合过程中成纤维细胞的细胞迁移运动至关重要。另一方面,在治疗烧伤和其他创面时,为了迅速覆盖创面,往往需要应用培养的角质上皮细胞,以促进创伤愈合。另外,在基因疗法,药理学应用策略以及同真皮代用品共同构建人工皮肤方面都需要应用培养的角质上皮细胞。要达成这样的目的,就需要一个可靠而有效的方法来体外培养角质上皮细胞,而目前的技术往往不尽人意。因此,该论文将研究真皮成纤维细胞在创伤环境中的迁移运动和发展一种可靠的角质上皮细胞获取及培养技术作为主要研究目的,并进一步在裸鼠动物模型上创建一个体外的在体人皮肤创伤愈合模型以供研究未来的细胞和药物疗法对创伤愈合产生的作用。该论文从结构上分为三个独立的单元,每个部分的摘要简述如下：第一章：应用于临床治疗和实验室研究的人体的原代培养的角质上皮细胞,一般是通过传统的组织分离技术获得的。然而,这种技术的应用通常需要依赖于饲养层细胞的支持,用于细胞培养的培养液通常也不能明确定位。而且,角质上皮细胞培养中通常存在真皮成纤维细胞污染的问题。当前,各国的研究者们一直在试图寻找一种可以从人体皮肤提取纯化的角质上皮细胞的方法,而这些细胞最好富含表皮干细胞或者祖细胞。这里,我们发展了一种创新技术,即应用皮肤外植体进行角质上皮细胞的原代培养。已证明这种新方法可以在短时间内产生大量角质上皮细胞,并且操作简单,效果稳定可靠,获得的细胞中没有成纤维细胞的污染。在皮肤外植体的培养过程中,我们观察到成纤维细胞和角质上皮细胞游出外植体的时间有明确的先后顺序,即成纤维细胞要比角质上皮细胞的游出延迟3-4天左右。我们就利用这一时间差,在培养初始的第3-4天,首先应用胰蛋白酶收获角质上皮细胞外生细胞层。我们随后将这些角质上皮细胞传代培养在特定的规范化培养液中,而脱离了对饲养层细胞的依赖。同传统的分离方法得到的角质上皮细胞相比,前者在培养中显示出更加快速的生长速率和更强大的细胞群落形成特性。而且,在细胞传代生长能力的比较中,分离方法取得的角质上皮细胞不能传代到3代以上,而应用皮肤外植体方法获得的细胞可以传代至第10代,且未见细胞分化。为了进一步研究这些角质上皮细胞的细胞学特性,我们首次应用抗体标记染色的方法来检测皮肤外植体产生的外生性细胞层以及传代细胞的细胞组成。我们应用了一系列干细胞／祖细胞标记物免疫染色来检测各种相关抗体的标记情况。结果显示,皮肤外植体衍生的角质上皮细胞含有高比例的表皮基底膜干细胞／祖细胞标记角质蛋白15(K15)阳性表达细胞,极少量的细胞表达细胞分化标记,角质蛋白10(K10)。K15是目前所知的表皮干细胞的标记之一。对收获前的皮肤外植体外生细胞层的免疫染色更进一步展示了这些细胞表达干细胞／祖细胞活性相关的标记,包括造血干细胞／祖细胞标记CD34；表皮干细胞／祖细胞标记CD133以及p63等。另外,细胞还表达角质蛋白6(K6),后者一般表达在表皮伤口愈合中激活的角质上皮细胞。我们认为这些来自皮肤外植体的表皮细胞是以一种模拟表皮细胞对创伤的反应方式主动迁移游出外植体的。相比于传统分离方法被动获得的细胞,前者因此具有更加强大的生长潜力。令人意想不到的是,当这些完成角质上皮细胞原代培养的皮肤外植体被回收利用,重新添加新鲜的培养液后,可以重复产生外生性角质细胞生长层,而可持续提供角质上皮细胞用于原代培养。这一发现使从少量的皮肤组织获取更多的角质上皮细胞以供临床应用成为可能。第二章皮肤创伤后,即刻产生内生性电流。已经证明,这一内生性电流可以指导表皮细胞的方向性运动迁移,而在表皮创伤愈合中扮演重要的角色。如前所述,创伤愈合过程中成纤维细胞的运动迁移至关重要。不过,这种内生性电流是否影响成纤维细胞的运动迁移,目前还不清楚。在这里,我们发现并证明小鼠的皮肤创伤后产生内生性电流,这一电流持续数小时至数天。我们继而应用不同强度的电场作用于培养的皮肤成纤维细胞,包括原代培养细胞和细胞株以观察细胞对电场作用的反应。在强度为50-100mV/mm的电场中,两种来源的人真皮成纤维细胞都显示出向电场正极方向的方向性运动趋势,不过与无外加电场的对照组细胞相比,细胞的运动速度相对减慢。这和表皮细胞对电场的反应形成鲜明对比,后者向电场的负极方向呈加速运动。不同于表皮细胞,真皮成纤维细胞在电场中向正极方向的方向性运动,至少要经过一个小时的时间才显示出来。我们之前的研究展示了电场通过激活Phosphatidylinositol-3-OH激酶(PI3-K;PI3激酶)信号传导通路而引起表皮细胞的向电极负极方向的趋电性运动,在当前的研究中,我们发现在给电10分钟内成纤维细胞的磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)水平就有明显的增高,最大程度的激酶激活状态的高峰表现在给电60分钟时,并在实验全程的5个小时之内都保持在这种较高水平。而在P13-激酶催化亚基,p110g基因敲除的小鼠,这种变化并不明显。我们的研究显示人真皮成纤维细胞在电场作用下出现的向正极方向的方向性趋电运动是由电场的强度和作用时间决定的剂量和时间依赖性运动。生理强度(100mV/mm)的电场需要作用长于1小时的时间才可显示出可观测到的细胞趋电性运动。研究同时显示,和表皮细胞相类似,在人真皮成纤维细胞对电场作用的趋电性反应中,P13-激酶扮演重要角色。外加电场激活真皮成纤维细胞内的P13-激酶信号,而明显增高磷酸化Akt的水平。这些结果建议,生理性电场可以引导真皮成纤维细胞的趋电性运动,而这种趋电性运动很可能是由P13-激酶信号传导通路以与同表皮细胞相类似的方式介导的。尽管早在150年前,人们就已经知道创伤可以产生电流,但是电流在创伤愈合中的作用却一直被忽略不计,更没有报道在基因水平上研究证实细胞对电流的反应。我们的研究首次证明人体真皮成纤维细胞在外加的生理性电场中产生趋电性的定向运动,并率先在基因水平提出成纤维细胞的这种趋电性是由P13激酶信号传导通路介导的理论。在当前研究的基础上,我们期待能在未来为临床的创伤愈合提供一个新的疗法,即应用小剂量的电场,模拟并且加强伤口的内生性生理电场,刺激皮肤成纤维细胞运动,加速向伤口区域聚集,从而加速伤口愈合。第三章这里介绍了建立一个在体的人体皮肤创伤愈合模型的初步研究。当前对创伤愈合研究的一个主要分支就是对人工皮肤替代品的研制开发。目前的研究趋势是将活性真皮成纤维细胞和／或表皮细胞与真皮代用品相结合来制备组织工程人皮肤替代物。然而,还没有一个理想的测试模型,可以更加准确真实地模拟人体的皮肤创伤愈合环境,以检验皮肤替代产品的临床功效。同时,也需要有一种能够向创伤中输送细胞的载体系统,以检测不同细胞以及细胞组合在创伤中的协同作用。当前实验的目的就是试图要建立这样一个体外的活体皮肤创伤模型,能最大限度地反映人体的在体皮肤创伤愈合过程,并且可以通过应用细胞载体系统来检验组织工程皮肤代用品和不同类型细胞对伤口愈合的影响,最终决定应用细胞疗法治疗伤口愈合的理想治疗方案。本实验中,我们将临床手术后病人的剩余皮肤事先移植到裸鼠背部皮肤缺损上,移植的全厚皮片在7天左右成活,2个月左右成熟至接近在体的皮肤形态结构。然后在成熟的移植人皮肤皮片上钻孔,创建一个全厚的人体皮肤的创伤模型。与此同时将培养的细胞直接接种培养在Integra上,应用Intergra作为细胞载体,将真皮细胞移植到伤口中,可以测试不同类型细胞对伤口愈合的影响。我们在实验中观察到了重新上皮化,真皮结构重建,基底膜重新形成等这些在体的皮肤创伤愈合过程特征可以在填充了真皮代用品的裸鼠人体皮肤伤口愈合模型上真实重现。我们这里介绍的短期研究率先应用移植的人体皮肤建立了体外皮肤创伤模型,并在此模型的基础上首次应用从市面上可以获得的皮肤代用品,例如Integra,和活细胞协同制备组织工程人工皮肤,以在上述模型中研究其对在体伤口愈合的作用。同时首次提出移植皮片在小鼠身上应用的最佳时机。这一模型有望成为一个理想的实验模型,来帮助我们理解人体伤口愈合中的机制性问题,并可应用其检测用于创伤愈合的细胞疗法之功效。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
第一章一种从皮肤外植体培养角质上皮细胞的创新方法  15-46
  1.1 介绍  15-17
  1.2 材料和方法  17-22
  1.3 结果  22-25
  1.4 讨论  25-29
  小结及本研究的不足之处  29-31
  附图表  31-41
  参考文献  41-46
第二章生理电场对人体成纤维细胞运动迁移的影响  46-75
  2.1 介绍  46-48
  2.2 材料和方法  48-52
  2.3 结果  52-54
  2.4 讨论  54-59
  小结  59
  本实验不足之处  59-60
  附图表  60-67
  参考文献  67-75
第三章可供研究细胞疗法和创伤愈合的体外人体皮肤模型的建立和应用  75-90
  3.1 介绍  75-76
  3.2 材料与方法  76-79
  3.3 结果和讨论  79-81
  小结  81-82
  本研究的不足之处  82-84
  附图  84-88
  参考文献  88-90
中英文缩略词表  90-92
致谢  92-94
博士研究生期间发表论文情况  94-95
参加国内国际会议  95-97
统计学审稿证明  97

关于人皮肤真皮和角质上皮细胞以及在体创伤模型的研究

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