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急性百草枯中毒大鼠肾组织中PPAR-γ与TGF-β_1的表达及5-氨基水杨酸的治疗干预研究

作　者: 马彧
导　师: 石汉文; 田英平
学　校: 河北医科大学
专　业: 急诊医学
关键词: 百草枯中毒肾损伤过氧化物酶增殖体激活受体-γ 转化生长因子-β1 5-氨基水杨酸
分类号: R595.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：百草枯（Paraquat，PQ），商品名有克无踪、对草快等，自20世纪50年代末发现其良好的除草作用后，一直被广泛应用于农业生产中。随着PQ在我国的大量使用，PQ中毒的发生率也逐年增高。临床研究发现，PQ毒性作用极强，且尚未发现特效解毒药，使得PQ成为我国继有机磷类及拟除虫菊酯类之后导致农药中毒的第三大种类。目前PQ染毒导致肾脏损伤的机制尚未完全明确。本实验研究通过测定PQ染毒大鼠的血清超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力以及丙二醛（MaleicDialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（L-Glutathione，GSH）含量，并应用免疫组织化学染色方法观察过氧化物酶增殖体激活受体-γ（PeroxisomeProliferator Activated Receptor-gamma， PPAR-γ）与转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）在PQ染毒大鼠肾组织中的表达以及5-氨基水杨酸（5-Aminosalicy acid，5-ASA）对上述指标的干预影响，进一步探讨PQ中毒对肾脏损伤的机制以及5-ASA对百草枯染毒大鼠肾损伤的保护机制，初步探索较大剂量5-ASA对于正常肾组织有无影响。方法：由河北医科大学实验动物中心提供的健康成年雄性Wistar大鼠80只，体重在200-230g之间。动物室温度控制在20-26℃之间，湿度控制在40-70%之间，动物饲料由实验动物中心提供，饮用水为纯净水与盐酸配制的放置24小时后的酸化水（pH2.5-3.0）。正式实验前适应性饲养3天，根据体重将大鼠随机分为4组：①空白对照组（A组）20只；②单纯染毒组（B组）20只；③染毒+治疗组（C组）20只；④单纯5-ASA对照组（D组）20只。实验当天早晨8点，B、C两组分别给予80mg/kg的PQ灌胃染毒，A、D两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注。上午10点，C、D两组分别给予75mg/kg的5-ASA胃内灌注，A、B两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注。实验后第1天上午10点，C、D两组分别给予75mg/kg的5-ASA胃内灌注，A、B两组分别给予相同体积的双蒸水胃内灌注，每日1次，最长用药时间为7天。A、B、C、D各组于实验后1d、3d、7d、14d分别取5只大鼠，10%水合氯醛0.35mg/kg腹腔注射全身麻醉，开腹后髂总静脉取血3-4ml，4000r/h高速离心10min，取上层血清测定SOD活力以及MDA、GSH含量，应用统计学方法进行组间比较；迅速留取右侧肾脏，取肾组织进行HE染色，镜下观察超微组织结构，并进行免疫组织化学染色，观察PPAR-γ和TGF-β1在大鼠肾组织中的表达情况。结果：1.实验大鼠临床表现：A组（空白对照组）及D组（单纯5-ASA对照组）大鼠未出现任何中毒表现。B组（单纯染毒组）大鼠在灌胃染毒后2小时之内即出现中毒表现，染毒后3日内症状最为明显。较短时间内即可观察到竖毛，易激惹，厌食水症状；之后可出现呼吸困难，尿量减少，体重减轻，部分大鼠有血尿、稀便，口鼻及眼周血性分泌物。C组（染毒+治疗组）大鼠经5-ASA治疗后，中毒表现较B组为减轻，呼吸困难明显改善，体重下降不明显，血尿、稀便及口鼻、眼周血性分泌物少见。2.实验大鼠血清学指标检测：①B组大鼠血清SOD活力在染毒后的1d为最低，至7d时间点仍明显低于A组（P＜0.01)，后逐渐升高，至14d后与A组相比不再具有统计学意义（P＞0.05）。C组5-ASA明显增加了大鼠血清SOD活力，在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显升高，具有统计学意义（P＜0.01）；仅1d、3d时间点较A组具有统计学意义（P＜0.05）。D组与A组比较，SOD活力在染毒后的所有时间点均不具有统计学意义（P＞0.05）。②B组大鼠血清MDA含量在染毒后的1d为最高，至7d时间点仍明显高于A组（P＜0.01）,后逐渐下降，至14d后与A组相比不具有统计学意义（P＞0.05）。C组5-ASA明显降低了中毒大鼠血清MDA含量，在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显降低（P＜0.01），仅1d、3d时间点较A组具有统计学意义（P＜0.05）。D组与A组比较，MDA含量在染毒后的所有时间点均不具有统计学意义（P＞0.05）。③B组大鼠血清GSH含量在染毒后的1d为最低，至3d时间点仍明显低于A组（P＜0.01），后逐渐升高，至7d后与A组相比不再具有统计学意义（P＞0.05）。C组5-ASA明显增加了大鼠血清GSH含量，在染毒后的1d、3d、7d时间点均较B组明显升高，具有统计学意义（P＜0.01）；所有时间点较A组均不具有统计学意义（P＞0.05）。D组与A组比较，GSH含量在染毒后的所有时间点均不具有统计学意义（P＞0.05）。3.实验大鼠肾组织形态学变化：①大体形态：A组大鼠肾脏色泽红润正常，被膜无肿胀；B组大鼠肾脏颜色晦暗，被膜肿胀；C组大鼠肾脏与B组相比颜色较红，被膜肿胀较轻；D组大鼠肾脏色泽红润正常，被膜无肿胀。②H E染色：A组大鼠肾组织中肾小球、肾小管、肾间质等各部分均未见异常；B组大鼠肾组织改变以肾小管为主，随着时间的推移，逐渐可见上皮细胞水肿、空泡变性、渗出坏死、管腔内可见红色坏死颗粒；C组大鼠肾组织改变与B组相类似，但程度有所减轻，发生时间有所延后；D组大鼠肾组织中肾小球、肾小管及肾间质均未见异常。4.实验大鼠肾组织PPAR-γ与TGF-β1免疫组织化学检测结果：4.1PPAR-γ在大鼠肾组织中的分布与表达：①A组大鼠肾组织中，偶见PPAR-γ表达于髓质肾小管、集合管上皮细胞核中。②B组大鼠肾组织中，可见PPAR-γ少量表达于肾小管上皮细胞核中，偶见表达于肾血管内皮细胞核中。与A组相比，自染毒后1d时间点，PPAR-γ的表达有所增高，1d、3d时间点即具有统计学意义（P＜0.05），7d及14d具有显著统计学意义（P＜0.01）。③C组大鼠肾组织中，PPAR-γ主要表达在肾小管、集合管上皮细胞核中，其次表达在肾小球系膜细胞、肾血管内皮细胞等细胞核中，还可观察到上述细胞的胞浆内有少量表达。应用5-ASA治疗后，自染毒后1d开始该组大鼠肾组织中PPAR-γ的表达就显著增高，至14d仍有明显表达，与A组及B组相比均具有明显统计学意义（P＜0.01）。④D组大鼠肾组织中，偶见PPAR-γ表达于肾小管上皮细胞核中。与A组相比不具有统计学意义（P＞0.05）。4.2TGF-β1在大鼠肾组织中的分布与表达：①A组大鼠肾组织中，仅在肾小管上皮细胞的胞浆内偶可见TGF-β1表达，而在肾小球及肾小管周围毛细血管等肾间质区未见明显TGF-β1表达。②B组大鼠肾组织中，TGF-β1主要表达在肾小管上皮细胞的胞浆内，自1d时间点开始就显著增高，至7d到达高峰，且至14d仍有明显表达，与A组比较具有明显统计学意义（P＜0.01）。③C组大鼠肾组织中，TGF-β1亦主要表达在肾小管上皮细胞的胞浆内。应用5-ASA后自1d至14d其表达较B组减弱，具有统计学意义（P＜0.05）；与A组相比，自1d至14dTGF-β1的表达明显增高，具有显著统计学意义（P＜0.01）。④D组大鼠肾组织中，TGF-β1在肾小管上皮细胞的胞浆内偶见表达，未在肾小球及肾小管周围毛细血管区等肾间质部位见其表达。结论：1.PQ灌胃染毒可造成肾脏损伤，主要表现为肾小管上皮细胞损伤，表明PQ灌胃染毒是建立急性肾损伤动物模型的可靠方法。以80mg/kg灌胃染毒，剂量合适。2.PQ中毒大鼠血浆中SOD活力降低， MDA含量增加，GSH含量减少，提示中毒大鼠体内存在过氧化损伤以及氧化—抗氧化失衡，可能是PQ导致肾脏损伤的机制之一。3.PQ中毒大鼠肾组织中的TGF-β1主要在肾小管上皮细胞的胞浆中表达，可能是造成肾小管损伤的原因之一。而PPAR-γ主要表达于肾小管、集合管上皮细胞的胞核中，说明其可能具有抗衡并修复前者对肾小管损害的作用。4.通过5-ASA治疗之后，可明显增加PQ中毒大鼠血清的SOD活力，降低MDA含量，升高GSH含量，从而减低氧化应激对于肾组织的损伤程度。5.5-ASA可能是PPAR-γ的配体，通过与体内PPAR-γ的结合并使之激活，直接保护受损肾组织细胞，间接抑制体内TGF-β1的表达，从而减轻PQ所造成的肾脏损伤。6.本实验研究未发现较大剂量5-ASA对于正常机体肾组织有损伤作用。

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摘要  4-8
ABSTRACT  8-14
英文缩写  14-15
前言  15-16
材料与方法  16-21
结果  21-25
附图  25-36
附表  36-38
讨论  38-42
结论  42-43
参考文献  43-46
综述急性肾损伤的诊断研究进展  46-55
  参考文献  50-55
致谢  55-56
个人简历  56

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