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AGEs抑制STZ诱导糖尿病大鼠肾脏D1受体表达及功能的研究

作　者: 黄丽妹
导　师: 孙敏
学　校: 安徽大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 糖尿病 晚期糖化终产物 氧化应激 多巴胺受体
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


由肾脏近曲小管(renal proximal tubular, RPT)分泌的多巴胺作为内源性排钠利尿激素,在钠负荷时负责超过60%的钠排泄。多巴胺主要通过位于近曲小管的多巴胺D1受体(Dopamine D1Receptors, D1R)发挥作用,D1R兴奋通过抑制钠泵如Na+-K+-ATPase的活性从而达到排钠利尿的作用。研究表明D1R激动剂不能刺激糖尿病大鼠钠排泄,原因是D1R表达和功能降低,钠泵活性增加,从而导致钠水潴留。糖尿病D1R表达和功能的降低仍不十分清楚,有学者报道STZ或者四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠脑组织中D1R表达降低,抑制氧化应激能恢复肾脏D1R的功能。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是蛋白质的氨基酸、还原糖的醛基之间发生非酶促糖基化反应的终产物,AGEs的形成过程是糖化和氧化的共同过程；由于肾脏结构和功能的原因,AGEs易沉积与肾脏并诱发肾脏损伤。氧化应激相关疾病如糖尿病、高血压、衰老均表现为机体AGEs水平增加,然而值得注意的是上述疾病均表现为尿钠排泄降低和钠潴留,提示AGEs与D1R表达和功能之间的联系,但是AGEs是否能降低D1R的表达和功能及与氧化应激之间的关系并不清楚。目的：研究AGEs对STZ-诱导糖尿病大鼠肾脏D1R表达和功能的影响,阐明糖尿病大鼠肾脏D1R功能降低的机理。方法：1.建立STZ诱导糖尿病大鼠模型：SPF级雄性SD大鼠,适应性喂养一周后,按35mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)连续3次,每周一次。最后一次STZ注射72h后测定空腹血糖,血糖值>300mg/dL的大鼠选为糖尿病大鼠。正常组大鼠腹腔注射等剂量缓冲液。将糖尿病大鼠随机分为模型组、Apocynin治疗组(APO组)和氨基胍组(AG组)并设正常对照组,每组8只。APO组和AG组大鼠分别按照200mg/kg/d和1OOmg/kg/d剂量灌胃给药,模型组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃,给药时间为5周。每天记录大鼠饮水量和进食量,每周记录大鼠体重及血糖。于实验结束前代谢笼收集24h尿液,并记录尿量。全自动生化分析仪分析血清肌酐、尿素氮、尿蛋白等生化指标的变化；取肾皮质于10%甲醛固定液中,制作病理切片,观察AG和APO对糖尿病大鼠肾脏病变的影响。2. AGEs对糖尿病大鼠钠潴留的影响：分组同上,于实验结束前,将大鼠放入代谢笼中,收集24h尿液,并记录尿量,连续2天,离心留取1ml尿液上清。收集尿液后,进行钠负荷实验：给予含1%NaCl的饮用水,自由饮水,其他饲养条件不变,连续3天。然后,将大鼠放入代谢笼中,收集24h尿液,记录尿量,留取1ml尿液上清。大鼠取血处死后,离心后取血清。将上述留取的尿液上清和血清用于检测尿钠浓度,研究抑制AGEs和氧化应激对糖尿病大鼠钠潴留的影响。3. AGEs对糖尿病大鼠肾脏多巴胺受体表达和功能的影响及其机理的研究：荧光法检测血清和肾组织AGEs水平；化学发光法检测血清和肾组织超氧阴离子和NADPH氧化酶活性；Western blot检测肾组织D1R的表达情况；ELISA法检测肾近曲小管cAMP水平和AC活性；试剂盒检测肾近曲小管Na+-K+-ATPase酶活性。结果：1.成功构建糖尿病大鼠模型：多次小剂量STZ注射后大鼠出现倦卧、神志萎靡、毛色枯黄、活动减少、及多饮、多食、多尿的表现,血糖值≧300mg/dL,并持续至实验结束。实验结果显示模型组大鼠肾脏指数增大,同时尿素氮、肌酐清除率等指标和24h尿蛋白量均明显增高,病理切片见多数肾小球体积不同程度增大,肾小球毛细血管腔扩张,肾小球系膜区扩张,基底膜不同程度增厚,肾小管扩张明显,上皮细胞水肿及破碎的程度加深。AG和APO降低肾脏指数、尿蛋白和肌酐清除率,改善了肾功能。因此,AGEs和氧化应激促进糖尿病大鼠肾脏损伤。2. AGEs对糖尿病大鼠钠潴留的影响：(1)模型组大鼠尿量较正常组显著增高(P<0.01),而尿钠及尿钾浓度低于正常组(P<0.001)；钠负荷后,模型组尿量高于钠负荷前尿量(P<0.001),表现多饮多尿现象,尿钠浓度显著升高,并且血钠浓度高于正常组,表现出钠潴留。(2)AG组和APO组大鼠尿量、尿钠及尿钾浓度较模型组高,但无统计学差异(P>0.05)。钠负荷后,AG组和APO组大鼠尿量明显高于模型组(P<0.05)；并且该两组大鼠的尿钠浓度较模型组高(P<0.05),血钠浓度低于模型组(P<0.05)而高于正常组(P<0.05),表现出促进尿钠排泄,改善了钠潴留。3. AGEs抑制糖尿病大鼠肾脏多巴胺受体功能的机理研究：(1)模型组大鼠血清和肾组织AGEs水平升高,超氧阴离子和NADPH氧化酶活性增加,体内的糖化和氧化过程增强。肾组织D1R的表达下降；同时基础状态cAMP水平和Fen刺激D1R后AC活性均降低；Na+-K+-ATPase活性增加。(2)AG组糖尿病大鼠血清和肾组织AGEs的水平降低,同时超氧阴离子和NADPH氧化酶活性下降。APO也降低了糖尿病大鼠体内氧化应激。AG和APO均能使糖尿病大鼠D1R表达量增加,并且基础状态cAMP水平和Fenoldopam刺激肾近曲小管AC活性高于模型组大鼠,但仍低于正常组。另外AG和APO降低了糖尿病大鼠Na+-K+-ATPase酶活性,与模型组比较具有统计学差异(P<0.05)。因此,AG和APO均降低体内氧化应激,增加D1R表达,从而提高Fen刺激的AC活性和Na+-K+-ATPase抑制作用的应答性,降低Na+-K+-ATPase酶活性。结论：1、 AGEs和氧化应激是导致糖尿病大鼠肾损伤的原因,AG和APO均能降改善糖尿病肾脏损伤。2、AGEs通过诱导氧化应激促进了糖尿病大鼠钠潴留。AG和APO具有改善糖尿病大鼠钠潴留的作用。3、AGEs通过诱导氧化应激抑制了糖尿病大鼠D1R的表达和功能,从而产生钠潴留现象。

全文目录


中文摘要  3-6
Abstract  6-10
目录  10-13
缩略词表  13-15
第一部分 前言  15-21
  1.1 糖尿病发病机制  15-17
    1.1.1 AGE-RAGE途径  15-16
    1.1.2 氧化应激  16-17
  1.2 糖尿病肾小管损伤与钠潴留  17-18
    1.2.1 糖尿病肾小管损伤  17-18
    1.2.2 糖尿病与钠潴留  18
  1.3 肾脏多巴胺受体与钠潴留  18-21
    1.3.1 多巴胺及其受体  18-19
    1.3.2 多巴胺受体信号转导  19
    1.3.3 糖尿病肾脏多巴胺受体功能降低与钠潴留  19-21
第二部分 STZ诱导糖尿病大鼠模型的建立及AGEs在糖尿病肾损伤中的作用  21-32
  一 材料  21-22
    1.1 试剂  21
    1.2 仪器  21-22
    1.3 实验动物  22
  二 方法  22-25
    2.1 溶液的配制  22-23
    2.2 动物模型的建立、分组及给药  23
    2.3 生化指标检测  23-24
    2.4 血清及尿蛋白浓度的测定  24
    2.5 形态学检测  24-25
      2.5.1 病理切片的制作  24
      2.5.2 病理切片的HE染色  24-25
    2.6 统计学方法  25
  三 结果  25-30
    3.1 AG和APO对糖尿病大鼠饮水量及进食量的影响  25-26
    3.2 AG和APO对糖尿病大鼠体重和血糖的影响  26-27
    3.3 AG和APO对糖尿病大鼠肾功能的影响  27-28
    3.4 AG和APO对糖尿病大鼠肾脏指数及肾脏病理形态学的影响  28-30
  四 讨论  30-32
第三部分 AGEs对STZ诱导的糖尿病大鼠钠潴留的影响  32-38
  一 材料  32
    1.1 试剂  32
    1.2 仪器  32
    1.3 实验动物  32
  二 方法  32-34
    2.1 溶液的配制  32-33
    2.2 动物模型的建立、分组及给药  33
    2.3 钠负荷实验  33
    2.4 统计学方法  33-34
  三 结果  34-36
    3.1 AG和APO对糖尿病大鼠尿量的影响  34-35
    3.2 AG和APO对糖尿病大鼠尿钾及血钾浓度的影响  35-36
    3.3 AG和APO对糖尿病大鼠尿钠及血钠浓度的影响  36
  四 讨论  36-38
第四部分 AGEs抑制糖尿病大鼠肾脏D1受体表达及功能的研究  38-61
  一 材料  39-40
    1.1 试剂  39
    1.2 仪器  39-40
    1.3 实验动物  40
  二 方法  40-50
    2.1 溶液的配制  40-44
    2.2 动物模型的建立、分组及给药  44
    2.3 肾近曲小管的分离  44
    2.4 荧光法检测血清和肾皮质AGEs水平  44-45
      2.4.1 血清AGEs水平  44
      2.4.2 肾皮质AGEs水平  44-45
    2.5 化学发光法检测血清和肾皮质超氧阴离子及NADPH氧化酶活性  45-46
      2.5.1 血清超氧阴离子和NADPH氧化酶活性测定  45
      2.5.2 肾皮质超氧阴离子和NADPH氧化酶活性测定  45-46
    2.6 肾近曲小管cAMP含量和AC活性测定  46-47
    2.7 免疫印迹法(Western Blot)检测肾组织D1R的表达  47-48
    2.8 肾近曲小管Na~+-K~+-ATPase酶活性的测定  48-49
    2.9 统计学方法  49-50
  三 结果  50-59
    3.1 肾近曲小管的分离  50
    3.2 AG和APO对糖尿病大鼠血清和肾皮质AGEs水平的影响  50-52
    3.3 AG和APO对糖尿病大鼠血清和肾皮质超氧阴离子及NADPH氧化酶活性的影响  52-55
    3.4 AG和APO对糖尿病大鼠肾近曲小管cAMP水平和AC活性的影响  55-56
    3.5 AG和APO对糖尿病大鼠肾皮质D1R表达的影响  56-57
    3.6 AG和APO对糖尿病大鼠肾近曲小管Na~+-K~+-ATPase酶活性的影响  57-59
  四 讨论  59-61
总结  61-63
参考文献  63-70
致谢  70-71
硕士期间发表的学术论文  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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