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基于抑制非酶糖基化效果的金耳液体发酵研究及其活性物质的初步分析

作　者: 郑俊丽
导　师: 丁重阳
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: 金耳非酶糖基化液体发酵多糖寡糖
分类号: TQ920.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

非酶糖基化是引起糖尿病并发症的主要因素之一，因此如何抑制非酶糖基化反应成为控制糖尿病并发症的重要手段。本论文以抑制非酶糖基化反应活性为指标，对金耳液体发酵培养基和发酵条件进行了优化。同时研究了金耳多糖及其他小分子量物质的分离条件，并对其结构进行初步分析。通过单因素试验得出，培养基成分中影响抑制率的主要因素是碳源和氮源，同时添加复合因子玉米粉和麸皮均可明显提高抑制率，而无机盐对提高抑制率作用不明显。在单因素水平实验基础上，进行了四因素（葡萄糖，蛋白胨，玉米粉和麸皮）三水平正交试验，确定了适合金耳液体发酵培养的最佳培养基组成为（g/L）葡萄糖10，蛋白胨5，玉米粉20，麸皮15，CoC_l20.5，MnSO₄0.5，培养基优化后的抑制率达75.82%。在优化培养基的基础上通过单因素试验得出最佳培养条件为：培养温度25oC，初始pH6.5，500mL三角瓶装液量150mL，接种量10%，优化后的抑制率达89.74%。通过对金耳活性物质的初步考察发现，其活性物质对温度较稳定，沸水浴煮后活性物质的活性基本未受到影响；除多糖外，还有其它极性物质具有抑制非酶糖基化的作用。通过醇沉、DEAE离子交换柱、凝胶柱等手段从金耳发酵液中分离纯化得到一种抑制非酶糖基化反应的金耳多糖，其分子量为1.37×10⁶Da，该多糖由岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖组成，各单糖摩尔比为：0.22:0.13:2.42:10.57:1.00:0.07。根据红外光谱和核磁分析，推测该多糖主要由吡喃糖组成，糖环构型中同时有α和β两种糖苷键结构。经高碘酸氧化和Smith降解得该多糖分子中存在1→3、1→4和1→6糖苷键或分枝末端基。酶解实验进一步证明了β-1,4糖苷键的存在。由部分酸水解结果推断该多糖主链主要由甘露糖构成，即该多糖属于甘露聚糖，并且主链主要以1,3-糖苷键方式连接。最后，采用大孔树脂吸附，C18柱，制备液相等分离手段，并通过液质联用分析发现在金耳发酵液中可能存在低聚寡糖，糖苷或生物碱类物质抑制非酶糖基化反应。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-8
第一章绪论  8-15
  1.1 引言  8
  1.2 糖尿病的研究  8-12
    1.2.1 糖尿病及其并发症  8-9
    1.2.2 糖尿病并发症药物治疗机制  9-12
  1.3 抑制非酶糖基化药物的开发  12
  1.4 中草药抑制非酶糖基化活性成分研究  12
  1.5 食药用真菌降血糖活性研究  12-13
  1.6 金耳研究现状  13-14
    1.6.1 金耳概述  13
    1.6.2 金耳药理活性  13-14
    1.6.3 金耳液体深层培养研究现状  14
  1.7 本课题立题意义  14
  1.8 主要研究内容  14-15
第二章材料与方法  15-23
  2.1 实验材料  15-17
    2.1.1 菌种  15
    2.1.2 主要试剂  15-16
    2.1.3 主要仪器与设备  16
    2.1.4 培养基  16-17
  2.2 实验方法  17-23
    2.2.1 液态发酵培养  17
    2.2.2 发酵培养基优化的单因素试验  17
    2.2.3 正交试验设计  17-18
    2.2.4 温度和起始 pH 的优化  18
    2.2.5 装液量及接种量的优化  18
    2.2.6 体外抑制非酶糖基化反应测定方法  18
    2.2.7 生物活性物质粗提取  18
    2.2.8 粗多糖 Sevag 法进一步除蛋白  18-19
    2.2.9 DEAE 离子交换柱纯化  19
    2.2.10 凝胶柱层析  19
    2.2.11 紫外光谱扫描  19
    2.2.12 多糖分子量测定  19
    2.2.13 单糖组成测定  19-20
    2.2.14 IR 分析  20
    2.2.15 NMR 分析  20
    2.2.16 高碘酸氧化和 Smith 降解  20
    2.2.17 酶解分析  20-21
    2.2.18 部分酸水解  21
    2.2.19 大孔树脂预处理  21
    2.2.20 C18 填料预处理  21
    2.2.21 制备液相色谱条件  21
    2.2.22 高效液相色谱与质谱联用分析条件  21-23
第三章结果与讨论  23-51
  3.1 以抑制非酶糖基化为目标优化金耳发酵培养基及培养条件  23-29
    3.1.1 不同碳、氮源对非酶糖基化反应抑制率的影响  23-24
    3.1.2 不同复合营养源对非酶糖基化反应抑制率的影响  24-25
    3.1.3 不同无机盐对非酶糖基化反应抑制率的影响  25
    3.1.4 正交试验及验证实验结果  25-26
    3.1.5 不同温度及初始 pH 对非酶糖基化反应抑制率的影响  26-27
    3.1.6 不同装液量对非酶糖基化反应抑制率的影响  27-28
    3.1.7 不同接种量对非酶糖基化反应抑制率的影响  28
    3.1.8 以抑制非酶糖基化为指标的发酵过程曲线  28-29
  3.2 对抑制非酶糖基化反应的金耳活性物质性质的初步考察  29-32
    3.2.1 金耳发酵液抑制非酶糖基化的活性物质受热稳定性  29-30
    3.2.2 不同有机溶剂处理后发酵液活性变化  30
    3.2.3 不同浓度酒精处理后发酵液活性变化  30-31
    3.2.4 金耳粗提物对非酶糖基化反应的抑制作用  31-32
  3.3 多糖分离纯化结果与分析  32-41
    3.3.1 DEAE 离子交换柱分离结果  32-33
    3.3.2 Sephacryl S-400 HR 凝胶柱层析  33
    3.3.3 紫外光谱分析结果  33
    3.3.4 TAP-3-1 纯度鉴定及分子量测定  33-34
    3.3.5 TAP-3-1 单糖组成分析  34-38
    3.3.6 红外光谱分析  38-39
    3.3.7 TAP-3-1 NMR 检测结果  39-40
    3.3.8 糖苷键分析  40
    3.3.9 酶解实验结果  40
    3.3.10 部分酸水解结果分析  40-41
  3.4 非多糖类活性物质的分离纯化  41-51
    3.4.1 大孔树脂静态吸附  41
    3.4.2 不同树脂对金耳发酵液活性成分静态吸附-洗脱性能试验  41-42
    3.4.3 D101 大孔树脂吸附放大实验  42-43
    3.4.4 C18 填料柱分离纯化  43
    3.4.5 制备柱纯化  43-44
    3.4.6 所分离物图谱分析  44-51
主要结论与展望  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-57
附录  57

基于抑制非酶糖基化效果的金耳液体发酵研究及其活性物质的初步分析

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