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KLF2调控Nrf2/Bach1在屋尘螨抗原处理的支气管上皮细胞中对抗氧化应激的作用

作　者: 肖敏敏
导　师: 戴爱国
学　校: 南华大学
专　业: 内科
关键词: 哮喘屋尘螨抗原支气管上皮细胞 Krüppe样转录因子2 核因子相关因子E2 BTB-CNC 异体同源体1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：哮喘的发病机制尚不十分清楚，气道的“自由基损伤”和“氧化/抗氧化失衡”学说已引起广泛重视。作为抵御外界刺激的首要防线，气道上皮细胞暴露于过敏原时，可以通过分泌多种趋化因子，吸引炎性细胞聚集于肺部并产生大量活性氧化物质（Reactive oxygen species,ROS)进而对肺组织造成氧化损伤。而屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus1,Derp1)抗原是一种普遍常见的室内过敏原，在哮喘的发病机制中起着重要的作用。本实验针对屋尘螨抗原，是否直接对大鼠支气管上皮细胞产生氧化损伤，同时检测大鼠气道上皮细胞中肺Krüppe样转录因子（Krüppel-like factor2,KLF2)、红系衍生核因子相关因子-2（NF-E2related factor2,Nrf2）、BTB-CNC 异体同源体1（BTB and CNChomology1,Bach1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS）的表达变化；此外，过表达KLF2基因，探讨KLF2与Nrf2、Bach1之间的调控机制，以及对γ-GCS基因的影响，在细胞水平探索抗氧化基因在在氧化应激及支气管哮喘发病中的可能作用，为未来哮喘的预防和治疗提供新的理论依据。方法：（1）选取体重约120~140g的雄性SD大鼠，以戊巴比妥钠处死大鼠。采用0.5%链酶蛋白酶对大鼠气道上皮侧进行4℃冷消化过夜，联用细胞刷机械刷洗获取大鼠气管、支气管上皮细胞，并置于无血清完全K-SFM培养基中进行原代培养。通过免疫荧光化学、电子显微镜等鉴定细胞，测定细胞成活率及细胞膜完整性。（2）予以大鼠支气管上皮细胞不同的干预及处理方式，随机将细胞分为:单纯培养组即对照组(A组)， Derp1抗原(5μg/ml)组即尘螨组(B组)，Derpl抗原((5μg/ml))+地塞米松(Dexamethasone，DEX)组即地塞米松组(C组)，分别培养8h，采用双酶法检测各组细胞γ-GCS活性；采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞KLF2、Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA的表达；采用免疫印迹（Westernblot）检测各组细胞KLF2、Nrf2、Bach1及γ-GCS蛋白水平。（3）采用质粒转染过表达KLF2基因，将大鼠支气管上皮细胞随机分为空白质粒组（A组）、KLF2重组质粒组（B组），用免疫荧光法观察A组和B组的质粒转染效果，用RT-PCR和Western blot检测各组质粒转染效率。再将以上两组细胞以对照组（1组）、尘螨组（2组）和地塞米松组（3组）以不同干预方式处理，采用RT-PCR检测各组细胞中Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA表达；用Westernblot检测各组细胞中Nrf2、Bach1及γ-GCS蛋白变化。结果:（1）采用低浓度链酶消化联合刷洗法取得的气管、支气管上皮细胞有较高的纯度和成活率，细胞于无血清K-SFM培养基中生长良好。免疫荧光显示细胞角蛋白（cytokeratin CK19）染色阳性，抗体主要表达于胞浆，符合支气管上皮细胞特性；电镜结果可见典型气管-支气管上皮细胞，细胞膜完整，胞浆内细胞器完好，细胞一侧有大量纤毛。（2）大鼠支气管上皮细胞中γ-GCS活性在尘螨组（B）组高于对照组（A）组（P<0.05），与地塞米松组（C）组比较无明显差异（P>0.05）；C组较A组升高，有统计学意义（P<0.05）。（3）RT-PCR结果显示KLF2mRNA表达在B组明显高于A组（P<0.01）及高于C组（P<0.05），C组KLF2mRNA表达强于A组，有统计学意义（P<0.05）；Nrf2mRNA表达在B组明显高于A组,（P<0.01）及高于C组（P<0.05），C组Nrf2mRNA表达明显强于A组，有统计学意义（P<0.01）；Bach1mRNA表达在B组低于A组和C组（P均<0.05）；C组与A组比较无明显统计学差异（P>0.05）；γ-GCS mRNA表达在B组明显高于A组和C组（P均<0.05），C组与A组比较无明显统计学差异（P>0.05）。（4）Western blot结果显示KLF2蛋白水平在B组明显高于A组（P<0.01）及高于C组（P<0.05），C组KLF2蛋白水平表达强于A组，有统计学意义（P<0.05）；Nrf2蛋白水平在B组明显高于A组（P<0.01）及高于C组（P<0.05），C组Nrf2蛋白水平表达强于A组，有统计学差异（P<0.05）； Bach1蛋白水平在三组间差异微小，无明显统计学意义（P>0.05）；γ-GCS蛋白水平在B组高于A组（P<0.05），C组γ-GCS蛋白水平表达强于A组，有统计学差异（P<0.05）。（5）免疫荧光结果显示lipo2000载体能有效将对照空白质粒及KLF2重组质粒转染入大鼠支气管上皮细胞中，空白质粒组（A组）的转染效率是60.4%，KLF2重组质粒组（B组）的转染效率为41.6%；RT-PCR结果显示B组KLF2mRNA表达强于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；Western blot结果显示B组KLF2蛋白水平明显高于A组，差异有统计学意义（P<0.01）。（6）RT-PCR结果显示Nrf2mRNA表达在B组较A组明显上调（P<0.01），A组中以A3Nrf2mRNA表达较其他两组高，有统计学意义（P<0.05）； Bach1mRNA表达在B组与A组中呈弱阳性，两组之间差异无统计学意义（P>0.05）；r-GCS mRNA表达在B组较A组上调（P<0.05）, A组和B组中均以（A2和B2）r-GCS mRNA表达较其他两组高，有统计学意义（P<0.05）。（7）Western blot结果显示Nrf2蛋白水平在B组较A组升高（P<0.05），A组和B组中均以（A2和B2）组上调，有统计学意义（P<0.05）；Bach1蛋白水平在B组与A组中无明显统计学差异（P>0.05）； r-GCS蛋白水平在B组较A组明显升高（P<0.01），A组和B组中以（A2和B2）组上调，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）屋尘螨抗原处理的大鼠支气管上皮细胞中存在氧化应激及抗氧化基因的动态表达，支气管上皮细胞在过敏原致敏的哮喘发病过程中可能起着重要的作用。（2）转录因子KLF2、Nrf2and Bach1在大鼠支气管上皮细胞氧化应激状态下，对γ-GCS进行动态调控，在维持细胞稳态平衡方面起着重要的作用。γ-GCS作为一种关键的抗氧化酶，其表达水平受转录因子KLF2、Nrf2正调控，受转录因子Bach1负调控。（3）过表达KLF2基因能增加Nrf2活性，并促进Nrf2核转位及核内表达，进而上调其下游靶基因γ-GCS，从而发挥重要抗氧化应激作用。在这次研究中，KLF2与Bach1无明显直接调控关系。（4）地塞米松可能通过影响两个关键抗氧化转录因子KLF2、Nrf2的表达，从而提高支气管上皮细胞抗氧化能力，同时减弱致敏原对细胞的氧化损伤，这为哮喘的抗氧化治疗方案提供了理论依据。

全文目录

主要缩略语  4-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-16
前言  16-20
材料与方法  20-29
实验结果  29-35
讨论  35-42
结论  42-43
参考文献  43-49
附图  49-55
综述  55-64
  参考文献  61-64
硕士期间撰写论文  64-65
致谢  65

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