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白细胞介素-23对哮喘小鼠记忆T细胞增殖功能的影响

作　者: 李艳春
导　师: 华树成
学　校: 吉林大学
专　业: 内科学
关键词: 记忆T细胞支气管哮喘白细胞介素-23 RNA干扰
分类号: R562.25
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：支气管哮喘目前被认为是一种Th2优势的疾病，记忆T细胞处于其发病机制的上游环节，它能够在哮喘机体长期存在，并维持Th2细胞的形态和功能，当机体再次接触同种过敏原时，记忆T细胞能够迅速增殖、活化为Th2细胞，分泌Th2细胞因子，引发气道炎症。因此，了解记忆T细胞在哮喘机体中的作用机制和规律，寻找可以调控记忆T细胞增殖与活化的物质，将有利于我们以记忆T细胞为靶点，探寻有效防治哮喘的新措施。IL-23能够促进正常机体记忆T细胞的增殖与活化，同时IL-23又能够促进哮喘小鼠Th2气道炎症，那么，IL-23是不是通过促进哮喘小鼠记忆T细胞增殖、从而促进哮喘Th2气道炎症的呢？本研究试图解答该问题，为治疗哮喘提供新思路。研究目的：1.了解哮喘小鼠肺脏、脾脏记忆T细胞比例在哮喘不同时期的变化规律，确定观察记忆T细胞增殖功能的最佳时间点，并为深入研究记忆T细胞在哮喘中的功能奠定基础；2.明确抑制IL-23是否能够减少哮喘小鼠肺脏记忆T细胞的数量，试图揭示IL-23参与哮喘Th2气道炎症的作用机理。研究方法：1.应用OVA致敏、激发小鼠，构建哮喘小鼠动物模型，于激发前1天始至激发后30天，按规定时间点处死小鼠，分离脾脏、肺脏，制成单个核细胞悬液，应用流式抗体、流式细胞仪检测小鼠脾脏、肺脏记忆T细胞比例，确定观察记忆T细胞增殖功能的最佳时机；2.根据小鼠IL-23p19基因序列设计干涉靶序列，慢病毒包装，体外感染小鼠细胞系，通过实时-PCR法检测细胞内IL-23p19mRNA表达水平，筛选出能够沉默小鼠IL-23p19基因的有效序列；3.将小鼠分为正常组、哮喘组、空载体组、哮喘IL-23p19基因沉默组，后2组模型致敏、激发方法与哮喘组相同，在第1次激发前1天经鼻滴入携带有空载体或有效干涉靶序列的慢病毒液。于前期实验确定的最佳时机处死小鼠，进行相关指标的检测，包括实时-PCR、免疫组化法检测IL-23p19基因体内沉默效果，流式细胞仪分析肺组织中记忆T细胞比例，实时-PCR法检测肺组织转录因子T-bet、GATA-3、RORC表达水平，HE染色、刚果红染色观察肺组织病理学改变以及PCR检测Th2细胞因子表达水平等哮喘炎症指标。结果：1.记忆T细胞检测结果⑴哮喘小鼠脾脏、肺脏CD4~+、CD4~-记忆T细胞比值均比正常小鼠明显增高（p<0.0001）；⑵CD4~+记忆T细胞变化规律：哮喘小鼠脾脏、肺脏CD4~+记忆T细胞在应用OVA激发后持续上升，激发停止后仍继续上升，肺脏CD4~+记忆T细胞在末次激发后2~9天达到高峰，峰值超过50%，后逐渐下降；脾脏CD4~+记忆T细胞在末次激发后7天达到高峰，峰值超过40%，后逐渐下降。至末次激发后30天，脾脏、肺脏记忆T细胞均回降至激发前水平；⑶CD4~-记忆T细胞变化规律：哮喘小鼠肺脏CD4~-记忆T细胞在应用OVA激发后持续上升，末次激发后2天达到峰值，然后迅速下降，至末次激发后7天时下降至激发前水平；脾脏CD4~-记忆T细胞于激发7天后始上升，维持在30%左右，于末次激发后14天下降至激发前水平；⑷在本模型的构建条件下，观察小鼠肺脏记忆T细胞增殖功能的最佳时机为末次激发后2天；2.沉默哮喘小鼠肺脏IL-23p19基因表达对小鼠的影响⑴记忆T细胞：哮喘基因沉默组小鼠肺脏CD4~+记忆T细胞占CD4~+T细胞比值较哮喘组降低（p <0.0001），CD4~-记忆T细胞占CD4~-T细胞比值无变化（p>0.05）；⑵Th2气道炎症：基因沉默组小鼠肺组织Th2细胞因子IL-4、IL-13mRNA表达较哮喘组降低（p <0.001，p <0.0001），肺组织炎症病变程度、嗜酸性粒细胞气道浸润均较哮喘组减轻（p <0.05，p <0.0001）；⑶转录因子：哮喘基因沉默组小鼠肺组织Th2转录因子GATA-3、Th1转录因子T-bet mRNA表达较哮喘组减低（p <0.0001）；Th17转录因子Rocr mRNA表达无变化（p>0.05）。结论：1.哮喘小鼠体内的记忆T细胞在哮喘不同时期呈现出一定的规律：⑴无论CD4~+还是CD4~-记忆T细胞，肺脏总是先于脾脏升高，且在哮喘急性期，肺脏记忆T细胞的比例显著高于脾脏；⑵在哮喘效应器官肺脏，CD4~+与CD4~-记忆T细胞均参与了哮喘的发病，其中CD4~+记忆T细胞是引起哮喘气道炎症持续的主要细胞，CD4~-记忆T细胞可能在哮喘急性发作方面发挥了作用；2.抑制IL-23表达能够减少哮喘小鼠肺脏CD4~+记忆T细胞的增殖，抑制Th2转录因子GATA-3的表达，同时能够减轻哮喘气道炎症，提示IL-23有可能通过调控CD4~+Tm的增殖来参与哮喘Th2气道炎症，IL-23主要对CD4~+Tm发挥作用。

全文目录

前言  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-13
英文缩略词表  13-16
第1章绪论  16-34
  1.1 记忆 T 细胞在支气管哮喘中的作用  18-23
    1.1.1 哮喘机体记忆 T 细胞的特点  19-21
    1.1.2 调控记忆 T 细胞的因素  21-23
  1.2 IL-23 对记忆 T 细胞的作用  23-30
    1.2.1 记忆 T 细胞表达 IL-23R  23-25
    1.2.2 IL-23 促进记忆 T 细胞增殖  25
    1.2.3 IL-23 促进记忆 T 细胞分泌 IL-17  25-28
    1.2.4 IL-23 促进记忆 T 细胞分泌 IFN-γ  28-29
    1.2.5 IL-23 促进记忆 T 细胞分泌 IL-22  29-30
  1.3 IL-23 在支气管哮喘中的作用  30-34
    1.3.1 IL-23 参与哮喘发病  30
    1.3.2 IL-23 促进哮喘 Eos 和 Neu 气道炎症  30-31
    1.3.3 IL-23 参与哮喘气道炎症的机制  31-32
    1.3.4 临床应用前景展望  32-34
第2章哮喘小鼠动物模型构建  34-52
  2.1 材料与方法  34-41
  2.2 结果  41-45
  2.3 讨论  45-50
  2.4 小结  50-52
第3章确定观察记忆 T 细胞增殖功能的最佳时机  52-66
  3.1 材料与方法  52-54
  3.2 结果  54-60
  3.3 讨论  60-65
  3.4 小结  65-66
第4章体外筛选能够沉默小鼠 IL-23P19 基因的有效序列  66-76
  4.1 材料与方法  67-71
  4.2 结果  71-72
  4.3 讨论  72-74
  4.4 小结  74-76
第5章抑制哮喘小鼠气道 IL-23P19 基因表达对记忆 T 细胞增殖功能及 TH2 气道炎症的影响  76-98
  5.1 材料与方法  77-82
  5.2 结果  82-94
  5.3 讨论  94-97
  5.4 小结  97-98
第6章结论  98
本课题的创新点  98-100
参考文献  100-118
作者简介及在学期间所取得的科研成果  118-120
致谢  120

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