学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化蛋白质组学研究及相关通路分析

作　者: 周新华
导　师: 赵彤
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学和病理生理学
关键词: H/RS细胞 B淋巴瘤细胞 CD99 mCD99L2 Septin-2 Stathmin
分类号: R733.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 85次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究背景和目的霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)是恶性淋巴瘤的一大类型,具有特征性的肿瘤细胞H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg)细胞,但H/RS细胞一般仅占肿瘤组织的极少部分(<1%),其余是大量以T淋巴细胞为主的炎性反应背景细胞,且经常发生变异,造成诊断上的困难。要把握H/RS的本质,就必须清楚H/RS细胞是如何发生、发展,与背景细胞之间究竟存在怎样复杂的相互关系,而要从根本上探究这些问题,迫切需要类似人HL病理特征的实验动物模型。目前虽然存在诸多人源性H/RS细胞株,但成瘤实验罕见报道,因为研究显示运用人H/RS细胞株时往往需要免疫严重缺陷的实验鼠如SCIDBNX或NOG鼠才能成瘤,但是越是免疫缺陷则越不能反映该肿瘤具有丰富免疫背景及炎症特性。因此构建鼠源性的H/RS细胞来构建鼠源性的动物模型成为研究的一个长期设想。Kuppers等研究者发现H/RS细胞来源于生发中心的残疾B细胞,认为生发中心B细胞在成熟过程中,一部分细胞经历了有利的突变选择,被T辅助及滤泡树突状细胞所选择,经过反复的增生、突变和选择,阳性选择细胞分化为浆细胞及记忆B细胞；而另一部分GCB细胞经过不利的突变,如反义突变、自身反应性的获得等成为功能上残缺的所谓前凋亡细胞,并经历了程序性细胞死亡一些残缺的前凋亡细胞丢失了被抗原选择的能力,从而没有经历正常的凋亡过程,成为H/RS前体细胞。H/RS细胞在克隆过程中其B细胞表面标志部分或全部消失,出现CD15、CD30特征性抗原标记物,成为H/RS细胞的生物学特性之一。由于H/RS细胞免疫表型及受体的改变,使其逃避免疫监视和细胞凋亡而得以生存及克隆性增殖。人CD99是一个糖基化跨膜蛋白,研究发现CD99的下调与人H/RS细胞的形成有关。本研究组前期通过脂质体转染CD99基因表达阴性的HL细胞株L428,筛选稳定表达CD99的L428-CD99细胞亚系,初步证实L428-CD99细胞亚系重现部分B细胞特征；同时发现鼠源性CD99(mouse CD99antigen-like2, mCD99L2)和CD99高度同源,通过慢病毒ShRNA质粒LV-mCD99L2转染内源性(?)CD99L2基因表达阳性的B淋巴瘤细胞株A20,筛选稳定表达干扰质粒的LV-mCD99L2-A20细胞亚系,初步证实有些LV-mCD99L2-A20细胞和人H/RS细胞有相似特征。本研究拟在构建稳定表达人CD99基因的L428亚系和稳定干扰鼠CD99基因的鼠B淋巴瘤A20细胞亚系的基础上,利用荧光差异凝胶双向电泳和质谱分析技术分别比较两种处理前后的细胞株蛋白表达差异,分离与鉴定与人、鼠CD99相互作用的靶蛋白,通过生物信息学研究分析方法得到的人、鼠两组数据,筛选出在细胞转化中起重要作用的蛋白,分析验证其功能及可能涉及的信号通路,为进一步阐明InCD99L2相互作用蛋白在构建H/RS细胞模型和类人HL动物模型中的作用和意义提供理论依据。研究内容与方法一、L428-CD99和LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定及分析1.L428-CD99细胞亚系的鉴定对前期构建的稳定过表达CD99基因的L428-CD99克隆株反复传代培养,利用RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、Western blot检测(?)CD99mRNA和蛋白表达；通过光镜观察、细胞计数和鬼笔环肽染色检测CD99基因过表达对L428细胞形态大小以及细胞骨架蛋白的影响；利用MTT实验检测CD99基因过表达对L428细胞增殖能力的影响；利用免疫细胞化学和流式细胞检测相关抗原标记分析CD99基因上调对L428细胞分化相关蛋白的影响。2. LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定对前期筛选出的稳定干扰1(?)CD99L2基因表达的LV-mCD99L2-A20细胞株反复传代培养,利用载体上通用引物进行PCR检测干扰载体整合至LV-mCD99L2-A20细胞情况；利用RT-PCR检测目的基因片段mCD99L2的mRNA表达,通过实时荧光定量RT-PCR检测mCD99L2基因的干扰效率；镜下观察观察mCD99L2干扰对A20细胞形态大小的影响,利用MTT实验检测]nCD99L2干扰对A20细胞增殖能力的影响。二、CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的蛋白质组学分析运用荧光差异双向凝胶电泳技术分别对人鼠两组转化细胞(人源性L428-CD99细胞／空载体转染的L428-CTR细胞和鼠源性LV-mCD99L2-A20和空载体转染的LV-Gus-A20细胞)进行蛋白分离得到差异蛋白凝胶电泳图,结合软件分析和手工筛选,与制备胶匹配后,挖取了差异蛋白质点,采用灵敏且高通量的肽质量指纹图谱蛋白质鉴定方法鉴定差异蛋白,进一步采用GOfact开放软件进行在线聚类分析(http://www.hupo.org.cn/gofact),对所得差异蛋白所参与的生物过程、所参与构成的细胞组件、所介导的分子功能进行注释,分析和细胞转化相关的蛋白。三、CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的差异蛋白筛选及初步验证1.筛选差异蛋白并分析通过生物信息学检索预测CD99和]mCD99L2相互作用的蛋白,结合双向荧光凝胶电泳和质谱分析得到的人鼠两组差异蛋白,筛选分析人CD99+/鼠mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的差异蛋白。2.筛选蛋白在人细胞、组织上的表达验证利用实时荧光定量RT-PCR、免疫细胞化学、Western blot和免疫荧光共聚焦检测筛选差异蛋白在人H/RS细胞转化细胞(L428-CD99和L428-CTR)和病理组织中的mRNA和蛋白表达。3.筛选蛋白在鼠源性细胞上的表达验证利用免疫细胞化学、Western blot检测筛选差异蛋白在LV-mCD99L2-A20和LV-Gus-A20细胞中表达。四、差异蛋白Septin-2在L428细胞和B淋巴瘤细胞初步功能验证及相关信号通路分析1、Septin-2蛋白与H/RS细胞和B淋巴细胞调控因子的关系信息学分析、western blot检测验证Septin-2与调控因子nf-kappaB和c-Myb的关系。2、Septin-2在H/RS细胞和B淋巴瘤细胞转化中初步功能验证瞬时干扰L428细胞中Septin-2表达,通过镜下观察、荧光共聚焦检测、CCK8实验和流式细胞检测Septin-2基因干扰对L428细胞形态、细胞骨架蛋白、细胞增殖能力和免疫表型的影响。3、Septin-2在H/RS细胞和B淋巴瘤细胞转化中可能参与的信号通路分析采用Western blot检测H/RS细胞L428稳定过表达CD99基因前后及瞬时干扰Septin-2基因前后相关通路蛋白的表达；结合蛋白组学分析结果,通过生物信息学和文献资料分析Septin-2在CD99调控H/RS细胞向B淋巴瘤细胞转化中可能参与的信号调控通路。结果一、L428-CD99和LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定及分析1.L428-CD99细胞亚系的鉴定(1) RT-PCR,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测显示,与空载体组比较,L428-CD99细胞亚系CD99基因和蛋白表达均增高。(2)培养细胞镜下形态观察、HE染色后计数,L428-CD99细胞亚系细胞体积变小,差异具有显著性(t=7.131,P=0.018)；鬼笔环肽染色发现,与对照组相比,L428-CD99细胞骨架发生重建。(3)MTT检测发现,CD99基因过表达组较空载体组增殖减慢,差异具有显著性(F=773.374,P=0.000)；(4)免疫细胞化学和流式细胞检测发现,CD99基因过表达后,与对照组相比,CD30、CD15和MUM1表达降低,CD10、CD19、CD79α、BCL-6、PAX5和CD38表达增高,而CD20和CD138的表达没有明显改变。2. LV-mCD99L2-A20细胞亚系的鉴定(1)PCR检测干扰载体稳定整合于LV-mCD99L2-A20细胞基因组,RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测LV-mCD99L2-A20细胞中目的基因片段mCD99L2的nRNA表达稳定降低,mCD99L2基因的干扰效率约51%。(2)传代培养细胞于倒置显微镜下和HE染色发现,LV-mCD99L2-A20细胞细胞体积明显增大,出现类人H/RS细胞的巨大细胞；MTT实验检测mCD99L2干扰使A20细胞增殖能力下降,差异具有显著性(F=77.452,P=0.000)。二、CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的蛋白质组学分析1.人源性转化细胞组荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析人源性转化细胞组通过荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析得到38个差异蛋白,与L428-CD99细胞而言正相关的蛋白21个,负相关的蛋白17个。其中RhoGDP-dissociation inhibitor2(GDIR2)和Septin-2(SEPT2)参与细胞骨架；DNAmismatch repair protein Msh2(MSH2), Hematopoietic lineage cell-specific protein(HS1)参与细胞分化；Rho GDP-dissociation inhibitor2(GDIR2)、Prostaglandin E synthase3(TEBP)、Prohibitin(PHB)、Hematopoietic lineage cell-specific protein(HS1)、Sorcin (SORCN)和GEM-interacting protein (GMIP)参与信号通路；Prohibitin (PHB)、Heat shock protein beta-1(HSPB1)和Hematopoietic lineage cell-specific protein (HS1)参与调节基因表达。2.鼠源性转化细胞组荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析鼠源性转化细胞组通过荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析得到41个差异蛋白,其中与LV-mCD99L2-A20细胞而言正相关的蛋白21个,负相关的蛋白20个。其中参与细胞骨架的蛋白有Actin, cytoplasmic1(ACTB)、Septin-2(SEPT2)、 PDZ and LIM domain protein1(PDLI1), Stathmin (STMN1);参与细胞分化的蛋白有stathmin (STMN1)、ADP-ribosylation factor-like protein6(ARL6);参与信号通路的蛋白有Ran GTPase-activating protein1(RAGP1)、 ADP-ribosylation factor-like protein6(ARL6);参与调节基因表达的蛋白有Eukaryotic translation initiation factor4E (IF4E)、Nucleophosmin (NPM)、60kDa heat shock protein, mitochondrial (CH60)、PDZ and LIM domain protein1(PDLI1)、Hypermethylated in cancer2protein (HIC2)> Poly(U)-binding-splicing factor PUF60(GCP60)等。三、CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化差异蛋白筛选及验证1.通过生物信息学检索和人鼠两组转化细胞差异蛋白的分析比较,选取骨架蛋白Septin-2和Stathmin作为验证的目标蛋白。2.实时荧光定量RT-PCR.免疫细胞和细胞化学、Western blot(?)和荧光共聚焦检测显示Septin-2和Stathmin的nRNA水平、蛋白水平在人转化细胞组L428和L428-CD99中存在差异表达,蛋白水平在组织标本中也存在差异,Septin-2和CD99表达负相关,Stathmin(?)和CD99表达正相关。3.免疫细胞化学、Western blot检测显示Septin-2和Stathmin在鼠源性转化细胞A20和LV-mCD99L2-A20中存在差异表达,与人源性转化细胞上表达一致。四、差异蛋白Septin-2在L428细胞和B淋巴瘤细胞初步功能验证及相关信号通路分析1. Septin-2上游调控因子NF-kappaB1、c-Myb和XBP-1也是促进H/RS细胞形成和B细胞分化的调控因子。Western blot检测显示NF-kappaB1和c-Myb参与H/RS细胞和B淋巴细胞的转化,Septin-2的表达受nf-kappaB、c-Myb调控,与nf-kappaB表达呈正相关,与c-Myb表达呈负相关；nf-kappaB和c-Myb不受Septin-2的调控。2.倒置显微镜下连续观察和荧光共聚焦检测显示L428瞬时干扰SEPT2后细胞骨架发生重建,细胞伪足状突起消失。3.CCK8试验显示与空载体组L428-cn细胞相比,L428-sisept2细胞株生长较缓慢,差异具有显著性(F=204.927,P=0.000)。4.流式细胞检测结果显示L428细胞瞬时干扰Septin-2后细胞的部分抗原标记出现了小幅改变,H/RS细胞特征性抗原标记CD30和CD15表达下降,B细胞抗原标记CD19表达上升,生发中心标记CD10和早期浆细胞标记CD38表达也有上升。5. Western blot检测发现,干扰L428中Septin-2和过表达L428中CD99表达,RhoA蛋白表达都明显降低；结合RhoGDI2、HS1、Stathmin等差异蛋白和信息学检索,提出CD99调控H/RS细胞和B淋巴瘤细胞转化过程中,可能通过上调RhoGDI2来抑制Rho Family GTPases信号通路中的Rho GTP酶,主要是抑制了RhoA活性,从而抑制细胞骨架GTP结合蛋白Septin-2的表达,促使骨架重建并抑制了细胞的增殖活性；同时Septin-2也能通过调节RhoA蛋白参与B细胞受体通路,和HS1共同平衡转化细胞的骨架重组,参与调节B细胞转录因子和B细胞抗原的形成分化。另一骨架蛋白Stathmin可能起到协同改变细胞骨架和形态作用。结论1.前期构建L428-CD99和LV-mCD99L2-A20细胞亚系反复传代培养并验证CD99+/mCD99L2-调控了H/RS细胞与B淋巴瘤细胞的转化；2.人H/RS细胞株L428过表达CD99后得到38个差异蛋白,21个表达上调,17个表达下调；鼠源性B淋巴瘤细胞株A20敲低mCD99L2表达后得到41个差异蛋白,21个表达上调,20个表达下调；部分蛋白参与细胞分化、信号通路、骨架改变和基因表达调节等功能,和细胞转化密切相关；3.骨架蛋白Septin-2和Stathmin在人鼠两组转化细胞中皆存在差异表达,Septin-2与CD99表达负相关,Stathmin与CD99表达正相关；4.初步验证了Septin-2在人H/RS细胞转化中通过骨架重建参与细胞形态改变,降低细胞增殖活性,参与H/RS细胞向B淋巴瘤细胞转化过程中的抗原分化；分析其可能主要通过Rho Family GTPases信号通路和B细胞受体的信号通路发挥作用。创新之处1.本研究通过蛋白质组学技术筛选CD99+/mCD99L2-调控了H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的差异蛋白,分析出一批和转化密切相关的蛋白；2.初步验证Septin-2的功能并分析相关作用信号通路,初步提出CD99调控H/RS细胞向B淋巴瘤细胞转化的分子机制。

全文目录

摘要  3-11
ABSTRACT  11-23
前言  23-33
  参考文献  27-33
技术路线  33-34
第一章 CD99+/L428-CD99和mCD99L2-/LV-mCD99L2 -A20细胞亚系的鉴定及分析  34-64
  一、材料和方法  34-44
  二、结果  44-57
  三、讨论  57-61
  参考文献  61-64
第二章 CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化的蛋白质组学分析  64-90
  一、材料和方法  64-68
  二、结果  68-82
  三、讨论  82-86
  参考文献  86-90
第三章 CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化差异蛋白的筛选及初步验证  90-111
  一、材料和方法  90-94
  二、结果  94-103
  三、讨论  103-108
  参考文献  108-111
第四章 CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化差异蛋白Septin-2功能的初步验证及相关信号通路分析  111-132
  一、材料和方法  111-115
  二、结果  115-123
  三、讨论  123-129
  参考文献  129-132
中英文缩略词表  132-134
全文小结  134-135
展望  135-136
攻读学位期间研究成果  136-137
致谢  137-139
统计学证明  139

CD99+/mCD99L2-调控H/RS细胞与B淋巴瘤细胞转化蛋白质组学研究及相关通路分析

内容摘要

全文目录

相似论文