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动脉粥样硬化未干预病变斑块易损机制的实验及临床研究

作　者: 李瑞建
导　师: 陈玉国
学　校: 山东大学
专　业: 急诊医学
关键词: 动脉粥样硬化易损斑块炎症氧化应激 CD36 支架置入
分类号: R543.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景近年来,经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗冠心病在我国迅速普及。据卫生部统计,2011年中国大陆PCI量已达332992例以上。然而,PCI术后不良心血.管事件(MACE)的高发生率,严重影响了冠心病介入患者预后及生活质量。因此,如何减少PCI术后MACE成为研究热点。研究认为PCI术后MACE产生不仅仅来自支架内再狄窄和／或血栓形成等,非靶病变斑块稳态的改变导致斑块进展和／或破裂引起越来越多关注。非靶病变又被称为未干预病变或临界病变,是指冠状动脉造影直径法测量狭窄程度为50%-70%的病变。因其狭窄程度较轻一般不引起心肌缺血,但非靶病变(临界病变)多属于不稳定斑块,易于破裂,导致心脏急性事件。临床研究发现PcI术后1年内高达12.4%MACE源目非靶病变,且在随后的4年内以每年6.3%速度递增。Stone等研究发现非靶病变进展多发生于狭窄程度较轻但具有易损性的斑块,且PCI术是非靶病变进展的独立预测因素,因此,推测PCI术可能会加速非靶病变易损斑块的进展。这一推论得到同类研究的证实。XU等通过冠脉造影发现冠脉介入术后8.5个月内43.7%的冠心病患者非靶病变斑块的迅速进展,基线炎症水平是其独立预测的重要因素。Nakachi等研究发现,不仅仅基线炎症与非靶病变斑块进展有关,PCI术后炎症加重也是非靶病变进展迅速的预测因素。因此,临床研究认为炎症在非靶病变斑块进展中起重要作用,但缺乏具体机制的基础研究。虽然临床研究证实他汀治疗能在一定程度上减轻非靶病变的进展,但仍有接近1/3的病人在长期随访中出现非靶病变进展的临床事件。因此,有必要进一步研究PCI术后非靶病变斑块进展机制并寻求更有效的措施。研究证实冠状血管成形术后炎症及氧化应激明显增加,并且支架置入术后炎症及氧化应激明显强于单纯球囊扩张术,原因可能归于异物置入、炎症及伴随氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)增加。BRUNETTI等发现急性冠脉综合征(ACS)PCI术后24小时炎症因子(IL-10,TNF-α,IL-18,IL-2及IFN γ)释放明显增加,且炎症反应与冠状动脉病变类型和复杂程序密切相关。Aggarwal等发现PCI术后1小时检测到白细胞介素-6(IL-6)增加,推测IL-6升高可能是PCI术后炎症反应的始动因素。Segev研究证实IL-6于PCI术后24小时达峰,7天回落至基线水平。动物研究证实动脉损伤可导致动物体内活性氧(ROS)水平增加及氧化应激反应。升高ROS从球囊损伤后24小时持续至14天,ROS的来源可能是由渗入受损血管的巨噬细胞被激活产生,为oxLDL的形成提供了条件。不论其来源,ROS水平增加及氧化应激反应产生很大的不利影响,诱导细胞功能障碍和影响损伤动脉愈合。有研究认为介入治疗引起的氧化应激反应与体内血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)水平升高及血管内皮对Ang Ⅱ反应性增加有关,Ang Ⅱ能通过激活NADPH氧化酶诱导氧化应激,并且该作用与CD36信号通路有关。CD36是近年来备受关注的细胞膜蛋白分子。CD36属于B族清道夫受体家族的一员,广泛分布于血小板、巨核细胞、单核细胞、微血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞等。研究表明炎症因子能上调单核巨噬细胞CD36表达。在糖耐量异常患者中IL-6能使sCD36浓度增加18%,机制可能与IL-6激活巨噬细胞从而导致其CD36表达增加。Keidar等研究认为IL-6类似于Ang日,能剂量依赖性增加CD36表达及巨噬细胞吞噬ox-LDL。另外,有体外研究发现IL-6刺激人脑毛细血管内皮细胞导致细胞内CD36蛋白的表达显着增加。Ox-LDL是体内氧化应激的产物,其通过与血管内皮细胞相应受体结合,诱导内皮细胞活化及损伤,致使内皮细胞表达粘附分子,诱导单核细胞粘附聚集并向内皮下迁移并分化成巨噬细胞。在巨噬细胞,CD36是oxLDI高亲和力受体,约占oxLDL结合受体的50%,是介导oxLDL进入血管内皮下主要受体。OxLDL进入内皮下后能反馈性上调循环中单核细胞表达CD36,导致巨噬细胞激活,泡沫细胞形成,致炎性因子释放及体内调节性免疫激活。Martin-Fuentes等通过体外分离和培养人单核-巨噬细胞,发现oxLDL刺激1小时后高反应性单核巨噬细胞即可高表达CD36,并且炎症因子IL-1β及IL-8表达明显增加。氧化应激反应能调节CD36表达,并且主要通过ox LDL及应激性高血糖途径完成。研究证实oxLDL体外刺激巨噬细胞4小时能上调CD36表达高达6倍,并且该作用持续24小时。研究发现应激性高糖能通过增加CD36mRNA转录效率而上调体外单核巨噬细胞表达CD36, Griffin等研究发现长时间暴露在高糖环境中巨噬细胞CD36的表达增加了5倍,主要原因是高糖刺激CD36mRNA的翻译效率增加。研究还发现血糖正常者高糖负荷2小时后单核细胞CD36表达明显增加,但该现象却没有发生于2型糖尿病患者,可能高糖刺激下迅速增加的CD36表达依赖于新CD36mRNA合成,并且有证据表明CD36蛋白储存于细胞内池并迅速转移至细胞表面。因此,高糖刺激增加的CD36mRNA转录效率出现在急性血糖波动而非慢性高血糖。另外,研究证实动脉粥样硬化(AS)斑块内,巨噬细胞能表达大量丰富的CD36蛋白,因此支架置入后循环CD36蛋白水平升高部分原因可能来自斑块内CD36释放。综合目前研究,我们不难看出炎症因子IL-6、ox-LDL及应激性高血糖均能够明显上调CD36信号蛋白表达。但是支架置入术后的炎症及氧化应激反应能否通过上调CD36蛋白表达影响非靶病变斑块易损及进展,目前尚不清楚。针对这一问题,我们在本研究通过构建AS支架置入且有非靶病变的动物模型,观察支架置入后炎症及氧化应激反应及其对CD36蛋白表达影响,分析了CD36蛋白表达与非靶病变进展关系,从而探讨支架置入后非靶病变易损机制及CD36信号通路作用,为进一步研究打下基础。研究目的(1)通过构建AS支架置入且有未干预的非靶病变动物模型,检测支架置入术对非靶病变稳定性及斑块进展的影响,探讨支架置入术后非靶病变易损及进展加速的机制。(2)探讨支架置入术后炎症、氧化应激及CD36表达变化以及其与非靶病变易损和进展加速的关系。研究方法1.支架置入AS模型的建立本实验室以往的研究发现,短期高胆固醇喂养所形成的家兔AS斑块均为稳定和较小的斑块,故本课题组采用大直径球囊损伤腹主动脉内皮+高胆固醇(1%)饲料喂养的方法,可造成负荷较大且分布较广的斑块。选择雄性纯种新西兰兔20只分成A组(15只)和B组(5只)。A组高脂饲料(1%胆固醇)喂养2周后,进行腹主动脉球囊拉伤术。B组单纯高脂饲料(1%胆固醇)。10周末A组行腹主动脉造影,根据实验方案选择腹主动脉上段及下段均有明显斑块的实验兔11只,随机分为A1组(支架置入组)和A2组(球囊损伤组),其中A1组实验兔支架置入术前因麻醉死亡1只被剔除,最终每组各5只。A1组兔进行腹主动脉造影及JVUS检查。选择合适部位(腹主动脉下段斑块最明显的部位)并置入金属裸支架(BMS,北京Partner公司惠赐),支架型号为3.0mm×12mm,以16～20个大气压释放支架,之后再行IVUS(?)检查。支架释放后1小时通过耳中动脉抽血4ml,留样待检。所有实验兔继续高脂饲料喂养于14周处死。2.血管内超声检查：支架置入前后及动物处死前行IVUS(?)检查。血管内超声的测量指标：病变部位及参考部位的血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)、斑块最厚处直径(Dmax)及其对侧斑块最薄处直径(Dmin)。(?)按照公式计算斑块偏心指数(EI):EI=(Dmax-Dmin)/Dmax:血管重构指数(PI)：重构指数即狭窄处EEMA/参考血管近远端EEMA平均值,参考血管采用的是原位IVUS(?)成像的斑块远端和近端5mm处相对正常的血管截面。正性重构：RI＞1.05；负性重构：RI＜0.95：RI值位于0.95与1.05之间的为无重构。3.血脂及血糖测定第10周、11周及动物处死前由兔耳中动脉抽取4mL动脉血标本,自凝后留取血清分装于Eppendorf管中,于-80℃冰箱中冻存,以氧化酶法检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-L)、高密度脂蛋白(HDL-L)等指标。单位以mmol/l表示。4.ELISA检查第10周(支架置入前)、术后1小时、术后24小时、第11周(术后1周)及动物处死前(术后4周)分别由兔耳中动脉抽取4mL动脉血标本,自凝后留取血清分装于Eppendor(?)管中,于-80℃冰箱中冻存,以氧化酶法检测血糖(Glu)浓度,采用ELISA(?)测定血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素(IL)-6、氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、CD36蛋白的浓度。5.组织病理学检查：非靶病变斑块定义为兔腹主动脉上段血管斑块组织,进行免疫组织化学染色观察巨噬细胞(RAM-11)、金属蛋白酶9(MMP9)、IL-6、CD36及肿瘤坏死因子a(TNF-α)在非靶病变斑块内局部表达。兔腹主动脉下段带支架血管段标本处理后甲醛浸泡并做好标记,送复旦大学附属中山医院行硬塑料包埋后,用硬组织切片机切片,每段血管切2片,根据SchwartZ等人描述的方法,Leica电脑微图象分析仪和NIKON显微镜加Scion Image微图象分析系统测定支架段血管切片的新生内膜厚度、面积。6.免疫印迹(Western blot):分别检测实验兔非靶病变斑块内IL-6、TNF-α、MMP-9及CD36蛋白质的表达。7.统计学分析：应用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示,符合正态分布的采用t检验,不符合正态分布的采用非参数检验Mann-Whitney检验,用中位数M(5%-95%)表示,均采用两个独立样本t检验,组间比较采用配对t检验。多变量比较采用ANOVA分析,计数资料采用x。检验,用Spearman相关性分析来分析变量间的相关关系,P<0.05具有统计学意义。结果①与对照组及球囊损伤组相比较,实验兔腹主动脉支架置入后1小时即可检测到炎症因子IL-6、ox-LDL及血糖明显升高；术后24小时儿-6水平达峰,术后7天及4周逐渐回落但仍然高于对照组及球囊损伤组；应激性高血糖峰值出现于术后24小时,术后7天回落至术前水平,与对照组无差异；oxLDL水平逐渐升高,持续至术后4周,并且明显高于对照组及球囊损伤组(P＜0.05)；②支架置入后非靶病变斑块进展更加明显,表现为管腔面积(LA)明显减少(7.29±2.14vs9.89±2.28,P<0.05),斑块面积(10.42±4.43vs6.54±1.99,P＜0.05)及负荷(57.42±9.29vs39.30±5.67,P＜0.05)明显增加。且斑块多为偏心性斑块(EI>0.5),正性重构更为显著(1.14±0.29vs1.07±0.23,P<0.05)：③免疫组化检查结果显示：支架置入组非靶病变斑块内含有大量的MMP-9(41.48%±4.24)、IL-6(51.82%±5.05)、TNF-α(51.46%±6.47)蛋白的表达,球囊损伤组内膜的泡沫细胞及中膜的平滑肌细胞内亦有MMP-9(13.51%±1.15)、IL-6(24.70%±2.55)、TNF-α(19.07%±1.72)的表达,但表达的数量明显低于支架置入组(P＜0.05)。与高脂喂养对照组(B组)比较,A组腹主动脉非靶病变斑块CD36及RAM-11表达的水平明显增加(P<0.01-0.05),且支架置入组(A1组)增加幅度明显高于无支架对照组(A2组)(P＜0.05)。④Western-blot检查结果显示：腹主动脉非靶病变斑块MMP-9、IL-6、TNF-α及CD36蛋白质表达呈现一致性,以对照组(B组)最少,其次为球囊损伤组(A2组),支架置入组(A1组)表达量最高。⑤血清CD36于术后24小时开始升高,其升高水平与炎症及氧化应激反应呈现明显正相关,说明炎症及氧化应激反应能上调CD36蛋白表达；CD36持续性升高直至兔处死前(术后4周)并且处死前CD36水平与斑块负荷呈正相关,表明CD36信号蛋白是介导非靶病变斑块进展的因素。结论1.行支架置入且存在非靶病变的AS动物模型构建：采用大直径球囊损伤+高脂喂养建立了AS动物模型,通过IVUS (?)检测证实此模型斑块分布较广,斑块形态学上具有与人类相似的特点(脂质斑块为低回声,斑块的纤维帽较薄)。经股动脉于新西兰兔腹主动脉下段斑块明显处置入支架而未干预腹主动脉上段病变,成功解决了股动脉血管细、易痉挛及支架脱载等技术难点,成功构建支架置入且存在非靶病变的AS动物模型构建,为进一步实践研究打下基础。2.本研究结果证实兔腹主动脉支架置入术后体内炎症及氧化应激水平明显增加,并且上述反应要明显强于单纯球囊损伤术。3.本研究结果发现支架置入后能加述非靶病变斑块易损性进展,为临床研究提供了有力的佐证4.本研究初步结果揭示了支架置入术后通过炎症因子及氧化应激反应等途径上调CD36蛋白表达,并且CD36蛋白表达上调与非靶病变斑块进展密切相关,为进一步深入研究打下理论基础。背景动脉粥样硬化(AS)易损斑块蚀损或破裂继发血栓形成是急性冠脉综合征(ACS)发病的主要机制。早在上个世纪九十年代研究就发现大约70%的ACS罪犯病变血管狭窄为小于50%的临界病变,这部分人群同样存在猝死的风险。临界病变,又被称为中等程度狭窄,是指冠脉造影(CAG)显示冠状动脉病变直径狭窄为50%-70%的病变,因其狭窄程度较轻一般不引起心肌缺血,但临界病变多属于不稳定斑块,易于破裂,导致心脏急性事件。临界病变斑块易损性是导致ACS的始动因素。深入研究临界病变斑块易损性的发生机制,探讨如何早期识别动脉粥样硬化病变中的易损斑块,并能够采取有效措施稳定易损斑块,使其“钝化”,是防治ACS的重要方法。研究显示CD36与斑块不稳定性的发生和进展密切相关。CD36属于B族清道夫受体,是一种细胞表面单链糖蛋白,广泛存在于多种不同种类的细胞,如单核巨噬细胞、血小板、微血管内皮细胞、平滑肌细胞等,能黏附和吞噬氧化低密度脂蛋白(oxLDI)进入巨噬细胞,最终变成泡沫细胞,构成动脉粥样硬化斑块的核心。OxLDI能通过CD36和PKC途径激活巨噬细胞产生炎症反应。炎症反应是斑块易损性最重要的内在因素之一。另外,oxLDI与CD36(?)合能通过上调血管内皮或内膜产生趋化因子来调节单核细胞浸润。不规则趋化因子((?)ractalkine, FKN)足CX3C趋化因子亚家族的唯一成员,其受体CX3CR1主要表达在NK细胞、T细胞和单核细胞上,介导表达fractalkine细胞对上述细胞的趋化作用。研究表明,FKN/CX3CR1系统参与并促进动脉粥样硬化炎症反应过程。与此同时,体外研究也发现CD36缺乏的巨噬细胞对趋化因子CCL2的趋化反应明显减弱。这此研究一致表明CD36和趋化因子在调节单核巨噬细胞浸润血管壁以及斑块进展方面存在协同作用,然而目前这方而研究甚少,并且CD36和趋化因子结合能否在动脉粥样硬化的不同时期发挥作用目前尚不清楚。本研究选择临床确诊不稳定性心绞痛患者,根据CAG结果分为冠脉临界病变组和严重病变组两组,通过比较CD36以及趋化因子fractalkine水平和血管内超声(IVUS)测量的斑块负荷等关系,并进行2年随访,探讨血清CD36及fractalkine与不稳定性心绞痛患者冠状动脉狭窄及预后的关系。对象和方法1研究对象选择2010年1月-2010年6月在山东大学齐鲁医院胸痛中心病房住院治疗的确诊为不稳定性心绞痛并行CAG检查的患者。根据CAG结果将患者分为冠脉临界病变组(罪犯血管斑块占管腔直径狭窄≤70%,A组)及严重病变组(罪犯血管至少存在一处斑块占管腔直径狭窄>70%,B组),对所有患者行IVUS检查。同时选择年龄和性别匹配的健康体检者40人作为对照组,对照组排除心脏病史,体格检查、胸片、心电图及心脏超声均无异常结果。2方法2.1血液标本的采集入选患者在山东大学齐鲁医院胸痛中心病房入院即刻采血,对照组在山东大学齐鲁医院健康查体中心就诊时采血。无菌条件下采集外周静脉血5ml,3000转／分离心10分钟后,留取血清标本并做好编号及标记,冻存于-80℃冰箱中以备检测。2.2血清炎性因子的检测血清中CD36和fractalkine水平采用ELISA法严格按照说明书进行检测。2.3冠状动脉造影与血管内超声检查冠状动脉造影检查于我院心血管介入中心进行,采用荷兰飞利浦公司产V-3000型心血管造影仪。首先进行CAG检查确定冠状动脉病变血管支数、血管狭窄部位以及程度等。血管直径狭窄是以病变前或后相对正常管腔直径作参照,病变处管腔直径丢失的百分比来表示。对于血管直径狭窄≥50%的病变,采用血管内超声仪(IVUS,美国Boston scientific公司产iLab型)进行病变部位的检查。有意义斑块定义为IVUS显示斑块面积负荷≥50%。斑块间正常血管段距离≥5mm定义为两个斑块。常见的IVUS测量指标包括斑块最厚处直径(Dmax)及其对侧斑块最薄处直径(Dmin)、血管外弹力膜面积(FEMA)、斑块面积(PA)、管腔面积(LA)等。按照公式计算重构指数(RI)、斑块负荷(PB)和偏心指数(EI):EI=(Dmax-Dmin)/Dmax,RI-病变处EEMA/参考部位近端与远端EEMA平均值,PB=PA/EEMA×100%。由两名经验丰富的操作者(陈文强和李大庆)独立分析CAG及IVUS图像,结果达到一致者纳入本研究。结果存在争议时有研究者共同决定。2.4随访采用电话及门诊两种方式对患者进行2年随访,终点事件是主要不良心血管事件(MACE),包括死亡,再次心肌梗死,严重心绞痛(Canadian Cardiovascular Society,CCS分级≥Ⅲ级)及再次血运重建术等。所有失访患者最终从本研究中剔除。2.5统计学分析：统计学分析应用SPSS17.0(?)软件进行。计量资料,符合正态分布的采用t检验,用x±s表示,不符合正态分布的采用非参数检验Mann-Whitney检验,用中位数M(5%-95%)表示,均采用两个独立样本t检验,组间比较采用配对t检验。多变量比较采用ANOVA分析,计数资料采用χ2检验,应用Kaplan-Meier曲线对比两组无事件生存率,P＜0.05具有统计学意义。3.结果3.1.基线资料和血清生物标记物的比较初选不稳定性心绞痛患者134例,最终完成随访患者120例,根据冠脉造影结果分为两组,其中临界病变组80例,严重病变组40例。对照组40例健康查体者,3组基线资料和血清生物标记物结果列于表1。CD36以及趋化因子fractalkine水平在不稳定性心绞痛患者中明显升高,且严重病变组升高更明显。3.2两组患者冠状动脉影像学检查结果比较80例临界病变患者中,80%患者是1支血管病变,2支及以上血管病变仅占20%。严重狭窄病变组中90%患者是2支及以上血管病变,1支血管病变仅占10%,两组间比较统计学有显著差异。IVUS检测结果示临界病变组检出斑块97处,严重狭窄病变组共检出斑块96处。两组患者的病变部位斑块主要以偏心斑块为主。两组患者的RI均大于1.05,病变部位均呈现为正性重构。临界病变组主要为脂质斑块(73%vs48%,P＜0.01),严重狭窄病变组钙化斑块和混合性斑块的比例高于临界病变组(P＜0.05)。进一步结果显示严重狭窄病变组病变部位血管的EEMA. PA及PB明显大于临界病变组,两组比较均具有显著的统计学差异(P<0.05～0.01)。Spearman相关性分析结果显示血清CD36(r=0.4068,95%CI:0.24-0.55; P<0.01)和fractalkine(r=0.43,95%CI：0.27-0.57;P＜0.01)水平均和IVUS测量斑块负荷(PB)呈显著性正相关。更重要的是,CD36和fractalkine之间相关性分析呈正相关(r=0.183,95%CI：-0.001-0.355;P=0.046)。3.3. IVUS指导临界病变介入治疗根据患者是否有典型的心绞痛症状,心电图或者动态心电图显示病变处于缺血靶血管,IVUS显示斑块负荷≥70%。符合上述标准的临界病变行冠脉介入治疗。80例临界病变组患者中有59例(73.75%)患者病变血管段有介入指征而行支架置入术,介入治疗组病变部位血管的EEMA、PA、PB、EI及RI明显大于非介入组(P<0.05～0.01),而LA明显小于非介入组(P<0.05)。而严重病变组有38例患者置入支架(95%vs73.75%,P<0.05),2例患者行心脏血管旁路移植术(CABG),支架置入89枚,人均2.3枚,显著高于临界病变组(77枚,0.96枚/人均,P<0.05),支架直径及长度两组间比较未见差异。3.4.随访随访2年,临界病变组有6例患者发生MACE,其中1例患者发生非靶血管心肌梗死并进行介入治疗,严重病变组有8例患者发生MACE,其中1例患者因非靶血管闭塞再次心肌梗死行介入治疗,1例患者因非靶病变进展引发严重心绞痛行PCI术。两组间对比严重心绞痛发生率有显著性差异(6.25%vs17.5%,P<0.05)。结论(1)本研究发现CD36、fractalkine能促进动脉粥样硬化斑块易损及进展,并且两者在致动脉粥样硬化斑块进展方面具有协同作用,这种作用不仅仅体现在动脉粥样硬化进展早期,而且在AS晚期仍然发挥重要作用。因此,临床上可以采用联合分析CD36、fractalkine作为判断冠状动脉斑块易损及预测其进展的指标。(2)IVUS在指导临界病变处理中要优于传统CAG。通过IVUS对冠状动脉临界病变进行充分评估后,选择性进行血运重建具有非常重要的临床价值。(3)本研究长期随访结果发现即使进行血运重建干预,不稳定性心绞痛患者中冠脉严重病变者仍有较高MACE发生率,特别是严重心绞痛的比例较高,需要进一步研究分析冠脉介入术后心血管事件发生机制并采取切实有效措施降低MACE发生率。

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中文摘要  6-12
ABSTRACT  12-17
符号说明  17-19
第一部分支架置入促进非靶病变斑块易损性的实验研究  19-87
  前言  19-24
  1 材料和方法  24-38
  2 结果  38-41
  3 讨论  41-56
  4 结论  56-57
  5 附表  57-59
  附图  59-76
  参考文献  76-87
第二部分不稳定性心绞痛患者冠状动脉临界病变斑块易损性的临床研究  87-124
  中文摘要  87-92
  ABASTRACT  92-98
  符号说明  98-99
  前言  99-100
  1 对象和方法  100-104
  2 结果  104-105
  3 讨论  105-112
  4 结论  112-113
  附表  113-116
  附图  116-119
  参考文献  119-124
致谢  124-125
攻读博士学位期间发表的论文  125-126
PAPERI  126-145
PAPERII  145-163
PAPERIII  163-182
附表  182

动脉粥样硬化未干预病变斑块易损机制的实验及临床研究

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