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低浓度毒死蜱对小鼠胚胎神经前体细胞周期性核运动及胚胎海马细胞的影响

作　者: 吴秀中
导　师: 陈晓萍
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 毒死蜱神经前体细胞周期性核运动胚胎海马
分类号: R384
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

有机磷农药毒死蜱(Chlorpyrifos, CPF)能影响发育期神经细胞增殖和分化,其作用机制尚不清楚。周期性核运动(interkinetic nuclear migration, INM)是顶端面神经前体细胞(apical progenitors, APs)在细胞增殖周期中沿着脑室壁的顶底轴进行的核往返性移动,是胚胎神经细胞发生中的特征性事件,也是成熟脑发育的基础。海马作为成熟脑学习记忆与行为的机能中心,形态结构的改变与认知行为异常具有密切的关联。本文主要从胚胎神经前体细胞周期性核运动和胚胎期海马形态角度评估胚胎早期CPF暴露对脑发育所产生的影响。首先建立孕鼠模式,在胚胎期14天(embryo days14, E14)以3小时为间隔,连续3次皮下注射5mg/kg CPF,对照组给予等量二甲基亚砜,在首次暴露CPF0.5小时、3.5小时或5.5小时腹腔注射50mg/kg溴脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine, Brdu),标记S期细胞,形成不同时间段核被标记的胚胎。首次暴露CPF6.5小时处死孕鼠,剥离胚胎,多聚甲醛固定后石蜡包埋,免疫组化染色,显微镜下计数脑室区(ventricular Zone, VZ)和脑室下区(subvertricular zone)中Brdu标记的细胞数,分析比较Brdu阳性细胞核在VZ和SVZ不同区域所占的百分比,从而评估CPF暴露对INM的即时影响。然后在胚胎E7.5-E11.5连续5天暴露5mg/kg/d CPF, E14注射50mg/kg Brdu,分别于1,3,6,9小时处死孕鼠,胚胎脑免疫组化染色后显微镜下观察,评估CPF对胚胎神经前体细胞的INM行为是否存在滞后效应。为了进一步评估CPF的暴露是否通过影响海马形态发育造成远期认知行为学改变,实验设计了于E7.5-E11.5暴露CPF的E16胚胎,脑组织进行冠状位连续切片,尼氏染色,取海马区3个标准平面,分别计数和分析细胞总数和细胞形态。研究结果发现,在即时暴露CPF实验中, CPF处理使周期性核运动迁移速度变慢,具体表现：Brdu标记后lhr,位于VZ外层的阳性细胞核增加8.3%,而中间层减少40.1%(P<0.01)；Brdu标记后3hr,位于VZ外层的阳性细胞核增加10.6%,中间层增加61.1%,而迁往VZ内层则减少82.0%,均存在极显著统计学差异(P<0.01)；Brdu标记后6hr,位于VZ外层的阳性细胞核增加25.1%,中间层增加39.3%,而VZ里层减少22.2%(P<0.01)。在预先暴露CPF实验中,CPF暴露对周期性核运动存在滞后效应,即在停止暴露CPF后,核运动速度仍然变慢。具体表现：Brdu标记后1hr,位于VZ外层的阳性细胞核增加6.5%,而中间层减少22.4%(P<0.01);Brdu标记后3hr,位于VZ中间层增加39.8%,而迁往VZ内层则减少25.9%,均存在极显著统计学差异(P<0.01)；Brdu标记后6hr,位于中间层增加15.1%,而VZ内层减少11.7%(P<0.01)。Brdu标记后9hr,位于VZ外层的阳性细胞核减少12.2%(P>0.05),中间层减少22.5%(P<0.01),VZ内层无明显改变,而SVZ区域增加95.3%,两者之间存在极显著差异(P<0.01)。研究胎鼠海马形态发现,经过CPF处理后,海马CAl区、CA3区细胞数量没有明显的变化,但比较DG区发现,细胞数量平均减少8.06%,前者存在显著差异,后两者存在极显著差异。因此对照组和CPF组DG之间细胞数量在统计学上存在差异。这些研究结果证明,胚胎期暴露5mg/kgCPF对胎鼠海马形态产生细微的影响。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-15
第一章综述  15-27
  1.1 引言  15
  1.2 胚胎神经发育  15-17
  1.3 周期性核运动  17-21
    1.3.1 INM的发现  17-18
    1.3.2 INM现象  18-19
    1.3.3 INM分子机制  19-20
    1.3.4 周期性核运动的作用  20
    1.3.5 INM与细胞周期的关系  20-21
  1.4 胚胎海马发育  21-23
    1.4.1 海马神经细胞的起源  21-22
    1.4.2 海马组织分层和功能  22-23
  1.5 神经发育毒  23-25
    1.5.1 胚胎暴露的影响  23-24
    1.5.2 新生期暴露的影响  24-25
  1.6 研究背景与意义  25-26
  1.7 课题设计与创新点  26-27
第二章 CPF暴露对胚胎神经前体细胞周期性核运动的即时作用  27-43
  前言  27-28
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 试剂及药品  28
    2.1.2 溶液配制  28-30
    2.1.3 主要仪器设备  30
  2.2 实验方法  30-35
    2.2.1 实验动物  30
    2.2.2 动物饲养  30-31
    2.2.3 定时胚胎制备  31
    2.2.4 分组和CPF处理  31
    2.2.5 Brdu标记  31-32
    2.2.6 胚胎采集与固定  32
    2.2.7 石蜡包埋与切片  32-33
    2.2.8 脑室定位  33
    2.2.9 免疫组化染色  33-34
    2.2.10 周期性核运动的测量  34-35
    2.2.11 统计学分析  35
  2.3 实验结果  35-40
    2.3.1 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记1小时)  35-36
    2.3.2 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记3小时)  36-38
    2.3.3 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记6小时)  38-40
  2.4 讨论  40-43
第三章 CPF暴露对胚胎神经前体细胞周期性核运动的滞后作用  43-55
  前言  43
  3.1 实验材料  43-44
    3.1.1 试剂及药品  43
    3.1.2 溶液配制  43-44
    3.1.3 主要仪器设备  44
  3.2 实验方法  44-46
    3.2.1 实验动物  44
    3.2.2 动物饲养  44
    3.2.3 定时胚胎制备  44
    3.2.4 分组和CPF处理  44
    3.2.5 Brdu标记  44-45
    3.2.6 胚胎采集与固定  45
    3.2.7 石蜡包埋与切片  45
    3.2.8 脑室定位  45
    3.2.9 胚胎脑切片INM免疫组化染色  45
    3.2.10 周期性核运动的测量  45-46
    3.2.11 统计学分析  46
  3.3 实验结果  46-52
    3.3.1 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记1小时)  46-47
    3.3.2 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记3小时)  47-48
    3.3.3 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记6小时)  48-50
    3.3.4 毒死蜱对神经前体细胞核运动的影响(Brdu标记9小时)  50-52
  3.4 讨论  52-55
第四章 CPF暴露对胚胎E16海马脑区细胞的影响  55-65
  前言  55
  4.1 实验材料  55-57
    4.1.1 试剂及药品  55-56
    4.1.2 溶液配制  56
    4.1.3 主要仪器设备  56-57
  4.2 实验方法  57-59
    4.2.1 实验动物  57
    4.2.2 动物饲养  57
    4.2.3 定时胚胎制备  57
    4.2.4 分组和CPF处理  57
    4.2.5 胚胎采集和固定  57-58
    4.2.6 E16胚胎石蜡切片步骤  58
    4.2.7 脑室定位  58-59
    4.2.8 形态学定位分析  59
    4.2.9 统计学处理  59
  4.3 实验结果  59-63
    4.3.1 对海马CA1区细胞数量影响  60-61
    4.3.2 对海马CA3区细胞数量影响  61-62
    4.3.3 对海马DG区细胞数量影响  62-63
  4.4 讨论  63-65
第五章实验总结与展望  65-66
参考文献  66-75
致谢  75-77
在读期间发表的学术论文  77

低浓度毒死蜱对小鼠胚胎神经前体细胞周期性核运动及胚胎海马细胞的影响

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