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鼠疫耶尔森氏菌蛋白对宿主NF-κB通路的影响及YpkA激酶活性的研究

作　者: 阳芬
导　师: 杨秋林; 杜宗敏
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 鼠疫菌 T3SS 报告基因 NF-κB 蛋白磷酸化
分类号: R378.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：1.病原菌的入侵通常引起宿主NF-κB信号通路的活化，鼠疫菌蛋白SycE、YscL、YscS是T3SS的组成成分，YscL是为T3SS转运效应蛋白提供能量的YscNATTPase的调控蛋白；YscS是分泌装置的成分蛋白。通过检测鼠疫菌蛋白SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL对宿主NF-κB信号通路的影响，对初步研究鼠疫菌可能的致病机制提供依据。2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白，VASP是人的一种细胞骨架调节蛋白，通过体外验证YpkA对VASP的磷酸化作用，对鼠疫菌的致病可能的机制进行初步的探讨。方法：1. LB液体培养基常规培养鼠疫耶尔森氏菌，试剂盒提取其基因组DNA。设计引物，PCR扩增yscL基因，插入pCMV-Myc质粒，构建重组质粒pCMV-Myc-yscL，经测序分析正确后大量提取质粒，去内毒素后用于转染293T细胞。2.大量提取本实验室已构建好的表达SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去内毒素提取质粒，转染293T细胞。3.利用瞬时转染技术，将以上提取的质粒分别转入293T细胞，以anti-Myc抗体为一抗，WB方法检测以上5种蛋白在293T细胞中的表达。表达正确后，再分别与表达萤火虫荧光素酶的pBII-LUC质粒和表达海肾荧光素酶的pRL-TK质粒共转染293T细胞。然后用TNF-α刺激293T细胞，在化学发光板上检测荧光素酶的活性。4.在大肠杆菌BL21中表达YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B珠子纯化YpkA；在293T细胞中表达VASP，Flag珠子纯化VASP。将纯化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶缓冲液混合，30℃反应30min，设立阳性和阴性对照组，分别用WB和同位素标记法检测VASP的磷酸化。5.统计软件SPSS13.0分析实验结果，统计方法为方差分析。结果：1.序列分析结果显示pCMV-Myc-yscL构建正确。2. WB结果显示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T细胞中得到正确表达。3.双荧光素酶报告基因实验结果显示：SycE、YPO3877、YscS和YscL实验组的荧光素酶活性比阴性对照组降低，差异有统计学意义（P <0.05）；YPO2940组荧光素酶活性比阴性对照组没有降低，差异无统计学意义（P>0.05）。4. WB结果没有检测到YpkA对VASP的磷酸化作用，而同位素标记法检测到了YpkA对VASP的磷酸化。结论：1.鼠疫菌蛋白SycE、YPO3877、YscS和YscL具有抑制NF-κB信号通路活化的作用，而鼠疫菌蛋白YPO2940没有抑制293T细胞NF-κB信号通路活化的作用。2.体外YpkA能够将VASP磷酸化。

鼠疫耶尔森氏菌蛋白对宿主NF-κB通路的影响及YpkA激酶活性的研究

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