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金黄色葡萄球菌Al-2群体感应以icaR依赖的方式减弱生物膜形成

作　者: 于丹
导　师: 孙宝林
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 金黄色葡萄球菌生物膜群体感应信号系统 AI-2
分类号: R378.11
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是引起人类生物膜(Biofilm)感染的重要病原体。自诱导物2(Autoinducer2, AI-2)是一种负责细菌种间交流的信号分子,在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的群体感应(Quorum-sensing, QS)中均起着重要的调控作用,但是它在金葡菌生物膜形成中所扮演的精确角色还不清楚。本文证明了在静止、流动、厌氧和体内小鼠模型中,金葡菌RN6390B中AI-2合成酶基因luxS缺失导致生物膜形成增强,通过在luxS缺失株(ΔluxS)中外源添加化学合成的AI-2前体,可以恢复其成为野生型的生物膜表型。实时定量反转录PCR分析表明,AI-2激活了ica操纵子的一个抑制子icaR的转录,导致icaA的转录水平下降,这有可能是金葡菌中luxS缺失影响生物膜形成的主要原因。另外,我们利用AluxS,RN6911和Δagr AluxS菌株,比较了agr介导的QS系统和LuxS/AI-2QS系统在金葡菌中调节生物膜形成的关系。数据显示,agr介导的QS系统和LuxS/AI-2QS系统在金葡菌生物膜形成过程中的调控作用呈现累加效应。这些发现证明,AI-2通过一个激活icaR的途径降低金葡菌生物膜的形成。这些研究结果为金葡菌生物膜相关感染的治疗提供了线索。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
目录  7-10
第1章绪论  10-46
  1.1 引言  10-11
  1.2 金黄色葡萄球菌生理特性及致病机制  11-21
    1.2.1 金黄色葡萄球菌的典型性质  11-13
    1.2.2 金黄色葡萄球菌感染  13-14
    1.2.3 毒力因子  14-15
    1.2.4 小菌落变异体  15-16
    1.2.5 毒力相关的基因调控  16
    1.2.6 金黄色葡萄球菌基因组结构  16-19
    1.2.7 甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌株  19-21
  1.3 生物膜的本质及特点  21-28
    1.3.1 EPS和生物膜结构  23-25
    1.3.2 生物膜基质主要成分  25-28
  1.4 群体感应信号系统调控生物膜形成  28-32
    1.4.1 群体感应信号系统  28-29
    1.4.2 群体感应信号系统对革兰氏阳性细菌生物膜形成的调控  29-32
  1.5 金黄色葡萄球菌的生物膜  32-36
    1.5.1 金黄色葡萄球菌生物膜的模式  33-34
    1.5.2 金黄色葡萄球菌生物膜形成的调控机制  34-36
  1.6 金黄色葡萄球菌生物膜所致的疾病  36-38
  1.7 宿主如何响应金黄色葡萄球菌生物膜感染  38-40
  1.8 治疗和预防金黄色葡萄球菌生物膜感染  40-46
    1.8.1 抗生素治疗  41
    1.8.2 抗菌剂直接作用于感染部位治疗  41-42
    1.8.3 疫苗  42-46
第2章实验材料和方法  46-56
  2.1 菌株与培养条件  46-47
    2.1.1 菌株  46-47
    2.1.2 培养基和染料  47
  2.2 分子克隆操作  47-48
  2.3 基因突变株构建  48-50
    2.3.1 金葡菌感受态的制备(100ml)  48-49
    2.3.2 luxS基因敲除株的构建  49
    2.3.3 αgr和luxS双基因敲除株的构建  49-50
  2.4 回补菌株构建  50
    2.4.1 质粒回补  50
    2.4.2 外源添加化学合成的AI-2回补  50
  2.5 荧光菌株的构建  50-51
  2.6 厌氧条件下的操作  51
    2.6.1 厌氧培养基的准备  51
    2.6.2 厌氧操作站的使用  51
  2.7 生长曲线的测定  51-52
    2.7.1 有氧条件下生长曲线测定  51-52
    2.7.2 厌氧条件下生长曲线测定  52
  2.8 生物膜的形成  52-54
    2.8.1 有氧静止条件下成膜  52
    2.8.2 厌氧静止条件下成膜  52
    2.8.3 流动相flow cell成膜  52-53
    2.8.4 体内导管模型中成膜  53-54
  2.10 扫描电子显微镜  54
  2.11 RNA的分离纯化  54-55
  2.13 实时定量反转录PCR  55
  2.14 Triton X-100诱导的细胞自溶检测  55
  2.15 伦理学声明  55
  2.16 统计学分析  55-56
第3章实验结果  56-72
  3.1 生物信息学分析luxS基因在细菌中的保守性  56-57
  3.2 金葡菌RN6390B中的LuxS  57-58
  3.3 luxS基因敲除  58-59
  3.4 AI-2以浓度依赖的形式抑制静止状态生物膜的形成  59-61
  3.5 AI-2抑制flow cell中生物膜的形成  61-62
  3.6 突变luxS基因导致体内生物膜形成增强  62-63
  3.7 AI-2抑制了icaA的转录水平  63-65
  3.8 AI-2激活了icaR的转录水平  65
  3.9 AI-2并不影响其他icaA调控子的转录水平  65-66
  3.10 AI-2抑制了厌氧条件下生物膜的形成和icaA的转录水平  66-67
  3.11 luxS突变株自溶速度减慢  67
  3.12 SH1000金葡菌株中luxS突变后不影响生物膜形成  67-68
  3.13 luxS缺失对细胞壁相关蛋白的表达没有显著影响  68-69
  3.14 LuxS/AI-2 QS系统和agr介导的QS系统在生物膜调控中起到了累加的效应  69-72
    3.14.1 激光共聚显微镜观测flow cell系统中生物膜形成的差异  69
    3.14.2 厌氧条件下静止状态生物膜形成的差异  69-70
    3.14.3 扫描电镜观测flow cell系统中的生物膜形成的差异  70
    3.14.4 厌氧瓶中生物膜形成的差异  70-72
第4章讨论  72-76
  4.1 关于本文实验结果可参考性的讨论  72
  4.2 关于体内AI-2回补的问题的讨论  72
  4.3 关于本文实验结果与之前研究结果差别的讨论  72-73
  4.4 关于AI-2影响icaR作用机制的讨论  73
  4.5 关于AI-2在多种菌群生物膜形成中作用的讨论  73-76
参考文献  76-86
致谢  86-88
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  88

金黄色葡萄球菌Al-2群体感应以icaR依赖的方式减弱生物膜形成

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