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醛固酮快速调控肾上皮细胞钠通道作用的研究

作　者: 陈学伟
导　师: 刘洪涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 醛固酮 EaNC mpkCCD TEER SICM
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究目的：醛固酮在调节细胞外液，维持电解质平衡以及控制血压稳定的过程中发挥着重要的作用，醛固酮重要的生理功能有赖于通过调控肾上皮钠通道（ENaC）对钠的重吸收，目前已知相关的作用机制分为基因组作用和非基因组作用。其中，研究较清楚的是醛固酮的基因组作用方式：醛固酮进入集合管主细胞后，与胞浆内的盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)结合，形成激素-受体复合体，后者进入细胞核与核中DNA特异性结合位点相互作用，调节特异性mRNA转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白(aldosterone-induced protein, AIP)，使管腔膜(apicalside)ENaC活性增强，基侧膜(basolateral side)钠钾泵的活性增加，从而促进跨上皮细胞的Na＋重吸收。醛固酮基因组作用的特点是作用起效较慢，作用时间长，对MR阻断剂敏感。此外,醛固酮还可发挥快速的非基因组作用来调控Na+的重吸收，此作用的特点为起效迅速,对MR阻断剂不敏感,但其内在机制还知之甚少。因此研究醛固酮非依赖MR快速调控ENaC的作用及其相关的作用机制，有助于进一步全面了解醛固酮调节ENaC作用的生理、病理意义，同时也可促进新型醛固酮拮抗药物的研发，为醛固酮快速作用提供可能的应对措施。主要内容：1建立具有ENaC活性的哺乳动物肾上皮细胞模型并进行评价。2研究醛固酮快速调控ENaC的作用。3探讨醛固酮快速调控ENaC的可能机制。研究方法：1．实验细胞模型的建立建立具有ENaC活性的哺乳动物肾上皮细胞模型-选择MDCK（Madin-Darbycanine kidney）、mpkCCD（mouse principle cell of kidney in cortical collecting duct）两种细胞株，培养成具有完整膜，有极性，高阻抗，阿米洛利敏感的细胞模型,最后通过观察细胞形态结构、测量跨膜电阻值、测量细胞单通道记录三个方面来评估，择优选出适合进一步实验的理想细胞模型。2．醛固酮对ENaC的快速调控作用给予醛固酮(10-6M/L)作用于mpkCCD细胞模型，观察醛固酮对细胞形态结构、阿米洛利敏感的跨膜电阻、胞内钙离子浓度、单通道离子电流的影响。使用MR阻断剂螺内酯以及醛固酮转录、蛋白合成抑制剂，验证醛固酮对ENaC快速（＜3小时）调节作用主要是非依赖MR的非基因组作用。3．醛固酮对ENaC作用机制的研究（1）通过使用PI3-K通路特异性的阻断剂LY294002(50um/L)验证PI3-K通路在醛固酮快速调控ENaC过程中的作用。（2）通过使用钙离子载体A23187（1um/L）快速增加胞内钙离子浓度来探讨胞内钙离子在醛固酮调控快速调控ENaC过程中的作用。（3）通过使用细胞松弛素D(Cyt D)打断细胞骨架F-actin,探讨细胞形态与ENaC功能活性之间的关系。4．主要的指标及测量方法（1）细胞形态学观察：扫描离子电导显微镜（SICM）（2）跨膜电阻值：跨膜电阻仪（EVOM2）（3）单通道离子电流：膜片钳cell-attached单通道记录（4）胞内钙离子:高速比率钙离子浓度测量荧光显微技术结果：1.建立了具有ENaC活性哺乳动物肾上皮细胞模型-mpkCCD细胞模型。2.醛固酮作用于mpkCCD细胞，细胞发生横向收缩纵向伸展，胞内钙离子浓度升高，整体膜和单通道水平的ENaC活性增强，表现为阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。3. LY294002能够阻断醛固酮对ENaC的激活作用，表现为细胞恢复原貌，阿米洛利敏感的跨膜电阻降低和离子通道开放概率减少。4. A23187能迅速增加胞内钙离子浓度，并增强ENaC活性，表现在阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。5. Cyt D能使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变，ENaC活性增强，表现为阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。结论：1.醛固酮能够快速增强ENaC活性。2.醛固酮快速增强ENaC活性作用机制可能是通过快速增加胞内钙离子浓度，激活PI3-K通路，使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变，从而增加的离子通道的开放概率。3. Cyt D能使细胞发生形变（横向收缩纵向伸展），ENaC活性增强，说明细胞骨架F-actin解聚有利于提高离子通道开放概率。

全文目录

目录  3-5
中英文缩略词  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-15
前言  15-19
第一章哺乳动物肾上皮细胞模型建立及评价  19-33
  一. 材料和方法  19-26
    1. 材料  19-21
      （1）细胞模型  19
      （2）主要实验试剂  19-20
      （3）主要实验仪器  20-21
      （4）主要溶液的配制  21
    2. 方法  21-26
      （1）细胞培养  21-22
      （2）SICM 扫描成像  22-24
      （3）跨膜电阻测量  24-26
      （4）单通道记录  26
      （5）数据统计  26
  二. 结果  26-30
    1. 细胞形态学  26-28
    2. 跨膜电阻测量  28-29
    3. 单通道电流记录  29-30
  三. 讨论  30-32
  四. 小结  32-33
第二章醛固酮对肾上皮钠通道的快速调控作用  33-49
  一．材料和方法  33-40
    1. 材料  33-35
      （1）细胞培养：  33
      （2）细胞分组  33
      （3）主要实验试剂  33-34
      （4）主要实验仪器与设备  34
      （5）主要溶液的配制  34-35
    2. 方法  35-40
      （1）扫描离子电导显微镜技术  35-36
      （2）跨膜电阻测量  36
      （3）膜片钳技术  36-39
      （4）胞内 Ca2+浓度测试  39
      （5）数据统计  39-40
  二．结果  40-46
    1. 醛固酮对 mpkCCD 细胞形态的影响  40-42
    2. 醛固酮对 mpkCCD△TEER 的影响  42
    3. 单通道电流记录  42-45
    4. 醛固酮对 mpkCCD 胞内钙离子浓度的影响  45-46
  三．讨论  46-47
  四．小结：  47-49
第三章醛固酮快速调控肾上皮钠通道的作用机制  49-61
  一．材料和方法  49-50
    1. 材料  49
      （1）mpkCCD 细胞培养  49
      （2）实验细胞分组  49
      （3）主要的仪器设备  49
    2. 方法  49-50
      （1） mpkCCD 细胞培养  49
      （2）实验细胞分组  49-50
      （3）主要实验技术  50
      （4）数据统计  50
  二．结果  50-57
    1. PI3-K 在醛固酮快速调控 ENaC 中的作用  50-54
    2. Ca2+在醛固酮快速调控 ENaC 中的作用  54
    3. 细胞骨架结构与 ENaC 功能活性的关系  54-57
  三．讨论  57-60
  四．小结  60-61
结论  61-63
参考文献  63-70
（综述）醛固酮对肾上皮钠通道（ENaC）的重吸收调控  70-77
  参考文献  73-77
发表的文章  77-87
个人简历  87-88
致谢  88

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