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PPAR-γ激动剂Pioglitazone在血管平滑肌细胞中调节KLF4表达的分子机制研究

作　者: 孙艳
导　师: 温进坤
学　校: 河北医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血管平滑肌细胞 Pioglitazone KLF4 PPAR-γ 蛋白稳定性
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：Krüppel样因子4（krüppel-like factor4, KLF4）是一种含有锌指结构的转录因子,其C端含有3个连续的C2H2锌指结构。KLF4通过直接或间接与靶基因启动子区DNA相结合，来调控相关靶基因的表达。已经证明KLF4调节细胞增殖、分化、发育、凋亡和炎症等细胞生物学行为。在血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC)中，KLF4通过调节VSMC标志基因和细胞周期调节基因的表达，对VSMC表型转化发挥重要的调节作用。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activatedreceptors, PPARs）是一类配体激活的核转录因子，可以通过直接或间接与目的基因启动子DNA相结合，来调控相关靶基因的表达。PPARs有三种亚型，即α、β/δ和γ。其中，对PPAR-γ的研究最为深入。PPAR-γ在多种细胞中均表达，包括脂肪细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞（endothelial cell,EC）和VSMC等。PPAR-γ能抑制细胞增殖、促进细胞分化并具有抗炎及抗动脉粥样硬化等作用。Pioglitazone作为PPAR-γ的激动剂，已经广泛应用于动脉粥样硬化、心肌梗死等多种心血管疾病的治疗。KLF4和PPAR-γ在调节细胞增殖和分化之间的关系是人们感兴趣的问题。然而，在VSMC中，PPAR-γ是否能调控KLF4的表达尚不清楚。本研究观察PPAR-γ激动剂Pioglitazone在血管平滑肌细胞中对KLF4表达的影响，探讨PPAR-γ调控KLF4表达的分子机制。方法：Western blot分析检测Pioglitazone对KLF4表达及不同信号通路活化的影响；转染靶向PPAR-γ的小干扰RNA敲低内源性PPAR-γ表达，检测KLF4蛋白表达；Real-time PCR检测KLF4mRNA水平；用荧光素酶报告基因分析检测Pioglitazone和PPAR-γ对KLF4基因转录的影响；细胞免疫荧光染色分析检测KLF4的表达量。结果：1PPAR-γ激动剂Pioglitazone促进KLF4蛋白表达Western blot分析显示，随着Pioglitazone浓度增加，KLF4的表达水平呈剂量依赖性升高，于10μΜ时达到高峰。随着Pioglitazone刺激时间的延长，KLF4的表达呈时间依赖性增加，于刺激12h后开始增加，刺激24h达高峰。细胞免疫荧光染色结果也显示，与对照组相比，Pioglitazone刺激后，KLF4免疫荧光染色强度呈时间和剂量依赖性增加。这些结果表明, Pioglitazone促进KLF4的表达。2Pioglitazone以依赖于其受体PPAR-γ的方式促进KLF4表达为了研究Pioglitazone是否通过激活其受体PPAR-γ来调控KLF4表达，我们用靶向PPAR-γ的siRNA转染VSMC，检测Pioglitazone对KLF4表达的影响。Western blot分析结果显示，敲低PPAR-γ表达后，KLF4蛋白表达水平降低；此外，敲低PPAR-γ表达能取消Pioglitazone对KLF4表达的促进作用。这些结果表明，PPAR-γ激动剂Pioglitazone诱导KLF4的表达依赖于其受体PPAR-γ。3PPAR-γ激动剂Pioglitazone不影响KLF4基因转录上述结果表明，PPAR-γ激动剂Pioglitazone促进KLF4蛋白表达。为了检测其对KLF4mRNA表达水平有无影响，我们进行了real-time PCR分析。结果发现，Pioglitazone对KLF4mRNA水平没有明显影响。荧光素酶报告基因分析结果显示，PPAR-γ表达质粒FLAG-PPAR-γ转染NIH-3T3细胞后， KLF4基因启动子活性没有明显变化，同时给予Pioglitazone刺激亦不影响KLF4基因启动子活性。上述结果表明，PPAR-γ激动剂Pioglitazone不影响KLF4基因转录。4PPAR-γ激动剂Pioglitazone增强KLF4蛋白的稳定性上述结果显示，PPAR-γ激动剂Pioglitazone促进KLF4蛋白表达，但不影响KLF4mRNA表达水平。我们推测，Pioglitazone能增强KLF4蛋白的稳定性。用20μg/ml放线菌酮（cycloheximide, CHX）孵育VSMC,Western blot检测KLF4蛋白水平，结果显示，用CHX阻断KLF4蛋白的从头合成后，Pioglitazone处理能使KLF4蛋白保持较高水平。上述结果表明，PPAR-γ激动剂Pioglitazone能增强KLF4蛋白的稳定性。5PPAR-γ激动剂Pioglitazone通过激活Akt信号通路增强KLF4蛋白的稳定性为进一步探讨Pioglitazone是通过激活哪条信号通路来增强KLF4蛋白的稳定性，我们首先检测了Pioglitazone对ERK、p38MAPK和Akt信号通路的影响。Pioglitazone（10μΜ）刺激VSMC0.5h，p38和Akt的磷酸化水平均显著升高,而ERK的磷酸化水平没有明显变化。结果说明，Pioglitazone能激活p38和Akt信号通路。我们用不同信号通路的抑制剂预孵育VSMC2h后，再给予Pioglitazone刺激24h，收集细胞进行Westernblot分析。结果表明，用ly294002抑制Akt信号通路后，Pioglitazone不再增加KLF4蛋白水平，即失去对KLF4蛋白的稳定作用。给予SB431542和PD98059后，Pioglitazone仍然能增加KLF4蛋白水平。这些结果表明，Pioglitazone通过激活Akt信号转导通路增强KLF4蛋白稳定性。结论：1PPAR-γ激动剂Pioglitazone促进KLF4蛋白表达。2Pioglitazone以依赖于其受体PPAR-γ的方式促进KLF4表达。3PPAR-γ激动剂Pioglitazone不影响KLF4基因转录。4PPAR-γ激动剂Pioglitazone增强KLF4蛋白的稳定性。5PPAR-γ激动剂Pioglitazone通过激活Akt信号通路增强KLF4蛋白的稳定性。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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