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IL-31真核表达载体的构建及其对HaCaT细胞增殖及炎症因子表达的影响

作　者: 黄海良
导　师: 张胜权
学　校: 安徽医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: IL-31 COS-7细胞 HaCaT细胞细胞周期
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 22次
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内容摘要

目的（1）克隆人白细胞介素-31（hIL-31）cDNA序列，构建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。（2）将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体转染COS-7细胞，筛选出稳定表达hIL-31的细胞株，分离并纯化hIL-31蛋白。（3）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，探讨其对IL-6、TNF-α mRNA和蛋白质水平表达的影响。（4）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，探讨其对细胞周期和细胞增殖的影响。方法（1）采用淋巴细胞分离液分离获得人外周血单核细胞,培养之后加入终浓度为20nmol/L的PMA，继续培养24h后收集细胞。（2）Tizol法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增hIL-31cDNA序列，并将其构建到真核表达载体pSecTag2/Hygro B上。（3）使用DNA转染试剂盒将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31转染至COS-7细胞当中，并使用潮霉素进行筛选，获得单个克隆后进行扩大培养，采用核酸蛋白检测仪进行蛋白质的分离与纯化。（4）使用不同浓度的hIL-31干预HaCaT细胞，采用Real-Time PCR的方法分析其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α mRNA表达的影响；ELISA法检测其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α蛋白表达的影响；MTT法分析其对细胞增殖的影响以及流式细胞仪检测对细胞周期的影响。结果（1）经菌落PCR、双酶切及测序分析鉴定,成功获得hIL-31基因cDNA全长序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。（2）成功筛选出稳定表达hIL-31的COS-7细胞株，并分离纯化出IL-31蛋白。（3）hIL-31能够显著诱导IL-6、TNF-α mRNA和蛋白水平的表达，并具有时间和剂量依赖效应。（4）小剂量、短时间的hIL-31抑制HaCaT细胞增殖的作用不明显；高剂量、长时间的hIL-31对HaCaT细胞的增殖有一定的抑制作用。（5）hIL-31可以改变HaCaT细胞周期，使得G1期细胞数量增加，S期和G2期细胞数量减少。结论（1）IL-31可以促进HaCaT细胞IL-6和TNF-α mRNA和蛋白水平的表达。（2）外源性的IL-31可以改变HaCaT的细胞周期，进而抑制细胞增殖，并且其效应具有时间和剂量依赖性。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
1 引言  11-12
2 材料与方法  12-30
3 结果  30-39
4 讨论  39-41
5 结论  41
6 参考文献  41-45
附录  45-46
致谢  46-47
综述  47-56
  1 IL-31 及其受体的分子结构  47-48
  2 IL-31 的生物学功能  48-49
  3 IL-3 1 参与的信号转导途径  49-50
  4 IL-31 及其受体的表达调控  50-51
  5 IL-31 与相关性疾病  51-52
  6 展望  52-53
  7 参考文献  53-56

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