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人睾丸优势表达蛋白与CT蛋白研究

作　者: 刘明兮
导　师: 沙家豪; 周作民
学　校: 南京医科大学
专　业: 生殖医学
关键词: 人睾丸蛋白质组睾丸优势表达蛋白 Cancer/Testis protein C1ORF14 1700012A16riken
分类号: R321
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：精子发生是一个高度复杂的细胞分裂和分化过程，它包括了精原细胞的自我更新、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态三个阶段，这些过程受到一系列睾丸优势表达基因（特异表达或者高表达基因）的调控。其中任何一个环节发生错误都可能会导致精子发生的异常，这已经被许多临床案例和各种基因敲除动物的试验所证实。同时生殖细胞与肿瘤细胞之间存在着很多相似性:包括了生殖细胞的永生化和癌症细胞的转化，生殖细胞的减数分裂和癌症细胞的非整倍体，生殖细胞的迁移和癌症细胞的转移等。在已知的睾丸优势表达蛋白中，存在一类蛋白被称作癌症/睾丸蛋白质（Cancer/Testis protein，CT protein）。这类蛋白质可以在癌症组织中异位激活，常作为癌症病人免疫原，是潜在的癌症分子标记和免疫治疗靶标。随着免疫学筛选或者mRNA表达数据库分析，超过138个CT蛋白或蛋白家族被发现。此外，在最近发表的果蝇研究中发现脑恶性肿瘤中一系列生殖细胞基因的异位表达，并且这种表达直接参与肿瘤进程。这些结果使得我们有理由相信睾丸蛋白质尤其是睾丸优势表达蛋白质同时参与精子发生和肿瘤发生。然而目前人睾丸蛋白质组的研究工作十分有限，通过质谱仅仅鉴定出约1500种蛋白质。与小鼠中的研究相比，数量极为有限。研究方法与结果：本次实验应用了高压液相色谱结合先进的LTQ Orbitrap Velos质谱，构建了目前最大的人睾丸蛋白质表达谱，包含7346种蛋白质。通过ProteinAtlas提供免疫组织化学数据分析可信度大于90%。与之前的研究相比，本次鉴定到的蛋白信号强度的分布大大的增加。建立了人睾丸蛋白质组公共数据库。进一步分析计算人类睾丸优势表达蛋白（HTPEPs）。发现323个蛋白质体现出睾丸优势表达的趋势并且富集于有性生殖、配子发生等生物学功能，对于精子发生和男性生育力有着重要的作用。同时初步发现新的CT（Cancer/Testis）蛋白：TMPRSS12、TPPP2、PRSS55、DMRT1、PIWIL1、HEMGN，C1ORF14等睾丸优势表达蛋白在肿瘤组织中存在异位表达，同时这些蛋白的编码基因又位于肿瘤发生可能的遗传多样性区域。对于人睾丸蛋白C1ORF14小鼠同源蛋白1700012A16riken蛋白进一步研究，证实1700012A16riken在小鼠中主要表达于睾丸。其表达起始于小鼠出生后14天小鼠睾丸粗线期精母细胞细胞质，减数分裂时呈纺锤丝状排列，减数分裂后至长形精子中逐渐减消失。1700012A16riken敲除雄性小鼠睾丸生精管腔中减数分裂阻滞精母细胞增多，导致精子数目的减少，影响雄性小鼠的生育力。1700012A16riken蛋白质与Hspa2蛋白质相互作用，但并不影响Hspa2表达。序列相似性分析发现Shcbp1、Fbxo11以及Fbxo10与1700012A16riken存在一定的序列相似性。这些基因在雄性小鼠睾丸中表达，在1700012A16riken敲除雄性小鼠睾丸中表达不受影响。此外应用免疫沉淀结合质谱技术鉴定到1700012A16riken高等哺乳动物中保守的4个蛋白修饰位点，提示这些位点可能参与1700012A16riken蛋白结构或功能。研究总结：这些新的CT蛋白的发现，为精子发生蛋白参与肿瘤发生提供新的分子证据，同时扩大了肿瘤免疫治疗抗原选择的范围。同时对于睾丸优势表达蛋白1700012A16riken的研究提示其在精子发生中发挥着重要作用，为研究男性生育能力下降提供了新的分子机制。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
第一部分：人睾丸优势表达蛋白在精子发生与肿瘤发生中的作用  10-33
  一、实验材料与方法  11-18
    1、主要生化试剂  11
    2、人睾丸优势表达蛋白研究  11-14
    3、 CT 蛋白研究  14-18
  二、实验结果  18-30
    1、人类睾丸蛋白质表达谱构建  18-21
    2、人类睾丸蛋白质组基本注释  21-22
    3、睾丸优势表达蛋白研究  22-26
    4、整合基因组关联研究（GWAS）发现新的 CT 蛋白  26-29
    5、睾丸中的其他癌症相关蛋白  29-30
  三、讨论  30-33
  四、小结  33
第二部分： 1700012A16RIKEN 功能研究  33-75
  一. 实验材料与方法  35-51
    1、实验动物：  35-36
    2、 RT-PCR 检测 1700012A16riken mRNA 多组织表达分布  36
    3、 1700012A16riken 重组蛋白表达与纯化及多克隆抗体制备  36-40
    4、 1700012A16riken 抗体特异性验证  40-43
    5、 1700012A16riken 敲除小鼠基因型验证以及敲除效率验证  43-44
    6、 1700012A16riken 敲除小鼠表型分析  44-47
    7、 1700012A16riken 蛋白相互作用蛋白筛选以及验证  47-50
    8、 1700012A16riken 预测相关基因检测  50-51
    9、蛋白质修饰位点鉴定  51
  二、实验结果  51-72
    1、 1700012A16riken 优势表达于小鼠睾丸  51
    2、 1700012A16riken 抗体制备以及特异性验证  51-56
    3、 1700012A16riken 蛋白的表达和定位  56-58
    4、 1700012A16riken 基因敲除小鼠模型敲除效率验证  58-60
    5、 1700012A16riken 蛋白的缺失导致雄性小鼠生育力下降，精子数量下降  60-64
    6、 1700012A16riken 蛋白的缺失导致雄性小鼠部分精母细胞减数分裂阻滞  64-67
    7、 1700012A16riken 蛋白质与 Hspa2 蛋白质相互作用  67-69
    8、 1700012A16riken 序列分析与蛋白修饰位点  69-72
  三、讨论  72-74
  四、小结  74-75
参考文献  75-84
文献综述人睾丸优势表达蛋白质--精子发生的关键，潜藏的肿瘤“推手”  84-107
  1、人睾丸优势表达蛋白质编码基因导致的男性生育力异常  86-88
  2、人睾丸优势表达蛋白质在模式生物中的研究  88-95
  3、人睾丸优势表达蛋白质异位表达与肿瘤发生  95-96
  4、人睾丸优势表达蛋白质编码基因表达模式的调控机制  96-98
  总结与展望  98-99
  参考文献  99-107
攻读学位期间发表文章情况  107-108
致谢  108

人睾丸优势表达蛋白与CT蛋白研究

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