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亚硫酸钠低氧模型的建立及TAT-Ngb脑保护作用研究

作　者: 蒋斌
导　师: 张成岗
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚硫酸钠秀丽线虫低氧大脑中动脉阻塞脑红蛋白
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胚胎发育、高原低氧、伤口愈合、炎症反应、肿瘤发生、缺血性疾病等等这一系列生理学和病理学的过程都与低氧有关。为了研究这些与低氧相关的疾病,人们建立了各种各样的低氧模型,大致可以分为物理低氧模型和化学低氧模型两类。虽然物理低氧模型能够较好地模拟造成动物或者细胞低氧损伤的低氧环境,但是建立过程相对繁琐复杂,其中通常需要含有95%氮气和5%二氧化碳气体的气瓶和能够维持低氧环境的密闭小室。氧气分析仪同样需要用来精确控制小室内氧气的浓度。化学低氧模型的建立需要低氧诱导剂,比如氯化钴、去铁敏、叠氮钠等。氯化钴和铁离子螯合剂去铁敏进行低氧模拟的原理是与参与氧感知过程的铁进行竞争。然而钴元素是一种重金属,容易引起组织和细胞中毒,并且钴元素模拟的仅仅是低氧引起组织损伤整个过程的一部分,因此难以真正模拟低氧损伤。还有一种低氧模型其诱导剂是连二亚硫酸钠,可以像物理缺氧那样剥夺掉溶液中的溶解氧,从而造成低氧环境。但是,连二亚硫酸钠属于易燃品,遇水发生放热反应,会生成亚硫酸钠和有毒气体二氧化硫,在模拟低氧环境的同时会带来其他严重副反应。因此,建立一种新的低氧模型进行低氧相关机制的研究显得尤为重要。我们通过文献分析了解到在工业上亚硫酸钠一直作为一种氧剥夺剂用于锅炉清洗中,可以避免锅炉过快的氧化腐蚀。并且,亚硫酸钠曾作为一种重要的食品添加剂用于食品保鲜,因为其可以形成无氧环境抑制微生物的生长。亚硫酸钠遇水不会发生放热反应,也不会产生二氧化硫。以上可以表明,亚硫酸钠作为一种氧剥夺剂用于生物学研究,具有连二亚硫酸钠所不具备的诸多优势,有可能是一种潜在的低氧诱导剂。首先,我们评估了利用亚硫酸钠在液体环境中建立低氧模型的可能性。结果表明,亚硫酸钠能够消耗掉水溶液中的溶解氧,并可在一定时间内维持水溶液的低氧状态,而且这种低氧状态及维持时间具有亚硫酸钠的浓度依赖性。这表明亚硫酸钠可以在液体环境中模拟低氧状态。其次,我们利用亚硫酸钠在秀丽线虫培养体系中建立了低氧模型。以物理低氧模型作为对照,我们评估了亚硫酸钠处理后线虫不同株系死亡率的统计、咽部损伤程度评价、神经元轴索断裂情况和低氧诱导因子HIF-1表达水平变化。我们分别选择野生型线虫N2株系、缺氧耐受型线虫daf-2(e1370)株系和缺氧敏感型线虫daf-16(mu86)株系这三种不同株系,在缺氧处理后进行死亡率统计,证明亚硫酸钠导致线虫死亡是由于缺氧造成的。结合不同浓度亚硫酸钠处理后的线虫死亡率统计图,我们发现2.0 g/L的亚硫酸钠溶液可以替代物理缺氧模型。经统计学分析认为两者之间的线虫死亡率模式没有统计学差异。线虫缺氧处理较短的时间并不能观察到明显的咽部空泡样改变。结合预实验结果,我们选择处理利用亚硫酸钠模拟缺氧处理16 h后进行DIC效果观察。从结果中我们同样可以得出2.0 g/L的亚硫酸钠可以在秀丽线虫中替代物理缺氧模型。缺氧处理同样会导致神经元出现损伤,具体表现为轴索断裂、呈串珠样改变。结果也同样表明,2.0 g/L的亚硫酸钠与物理缺氧处理所导致的损伤程度一致,可以替代物理缺氧模型在秀丽线虫中建立一种新的低氧模型。经不同浓度的亚硫酸钠处理后,线虫CeHIF-1(F38A6.3a)和CeHIF-1(F38A6.3c)两种变体都出现稳定的表达上调。这表明亚硫酸钠导致的低氧环境能够激活线虫体内的HIF-1低氧信号通路,从机制上肯定了亚硫酸钠能够用于低氧模型的建立。低氧是造成神经系统损伤的重要原因,临床上以缺血缺氧性脑损伤为主的脑血管疾病给患者乃至整个社会带来极大负担。因此,揭示抗缺氧损伤的关键分子机制对临床预防和治疗此类疾病有着重大的现实意义。相应地,对于包括脑中风在内的脑血管疾病相关治疗药物的研发一直是医学界的研究重点。因此,我们还建立小鼠大脑中动脉阻塞模型(即脑中风模型),用于评价连接有穿膜肽TAT标签的脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb)的神经保护作用。脑红蛋白是新发现的主要表达于脊椎动物神经元以及视网膜中的第三类携氧珠蛋白。已有诸多报道认为脑红蛋白对由于缺氧或者缺血造成的脑损伤具有一定的神经保护作用。目前已有证据表明Ngb可以作为活性氧簇(ROS)的清除剂有可能起到重要保护作用,但其神经保护作用的具体机制依然不明。我们采用线栓法建立小鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO)模型。同时,优化了TTC染色方法,这能够对梗死灶位置以及面积进行精确判定,可显著提高脑缺血模型中梗死灶的检测效率。基于此模型,我们分析了小鼠给予尾静脉注射不同浓度的TAT-Ngb蛋白后脑梗死面积的变化。结果表明,低浓度的TAT-Ngb能够显著减少脑缺血再灌注损伤导致的梗死面积。这可能与TAT标签能够促进Ngb血脑屏障的透过率有关。综上可知,我们分析了亚硫酸钠溶液中溶解氧含量的变化模式,并以此在秀丽线虫中建立了亚硫酸钠低氧模型。另外,我们通过小鼠MCAO模型评价认为TAT-Ngb具有一定的神经保护作用。本研究对低氧损伤机制探索及相关低氧和脑保护药物的研发具有重要的意义和参考价值。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
第一章亚硫酸钠溶液中的溶解氧及pH值的测定  14-27
  第一节溶液中溶解氧测定方法的建立  14-19
    一、实验材料  14
    二、实验方法  14-15
    三、结果及讨论  15-19
  第二节利用PBS缓冲液配制的亚硫酸钠溶液中的溶解氧及pH值的变化  19-23
    一、材料和方法  19-20
    二、结果  20-22
    三、讨论  22-23
  第三节利用M9 buffer配制的亚硫酸钠溶液中的溶解氧及pH值的变化  23-27
    一、材料和方法  23-24
    二、结果  24-25
    三、讨论  25-27
第二章氧百分含量与溶解氧之间的转换  27-32
  第一节氧百分含量与溶解氧之间的转换关系  27-30
    一、原理介绍  27-28
    二、物理低氧模型中溶解氧含量的计算  28-29
    三、讨论  29-30
  第二节物理低氧处理后溶解氧恢复曲线的测定  30-32
    一、材料和方法  30
    二、结果  30-31
    三、讨论  31-32
第三章利用亚硫酸钠在秀丽线虫中建立低氧模型  32-51
  第一节秀丽线虫培养方法及Feeding RNA干涉处理  32-36
    一、材料方法  32-34
    二、结果  34-35
    三、讨论  35-36
  第二节亚硫酸钠对不同株系线虫死亡率的影响  36-42
    一、材料方法  36-37
    二、结果  37-40
    三、讨论  40-42
  第三节亚硫酸钠处理导致线虫咽部及神经元出现损伤  42-48
    一、材料方法  42-43
    二、结果  43-47
    三、讨论  47-48
  第四节亚硫酸钠处理导致线虫体内低氧诱导因子稳定性表达  48-51
    一、材料方法  48-49
    二、结果  49-50
    三、讨论  50-51
第四章脑红蛋白对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用  51-66
  第一节线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型  51-56
    一、材料方法  51-53
    二、结果  53-54
    三、讨论  54-56
  第二节 TTC染色技术的优化  56-61
    一、材料方法  56-57
    二、结果  57-60
    三、讨论  60-61
  第三节尾静脉注射TAT-Ngb治疗小鼠缺血再灌注损伤  61-66
    一、材料方法  61-62
    二、结果  62-64
    三、讨论  64-66
全文结论  66-67
参考文献  67-70
附录一主要溶液的配制  70-74
附录二氧在不同温度和氯化物浓度的水中饱和含量表  74-75
主要仪器设备  75-76
文献综述  76-82
  参考文献  79-82
在学期间发表的论著  82-90
个人简历  90-91
致谢  91

亚硫酸钠低氧模型的建立及TAT-Ngb脑保护作用研究

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