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黄连素抑制福氏志贺菌的作用机理及GadB蛋白功能的研究

作　者: 赵天
导　师: 廖祥儒
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄连素双向电泳 GadB蛋白基因敲除福氏2a志贺菌
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

志贺氏菌(Shigella spp.)是一种最常见的引起人类腹泻的病原菌,严重威胁人类健康。抗生素作为一种见效快、成本低和易推广的治疗志贺氏菌的方法具有其现实意义。但是随之产生的细菌耐药性问题也困扰着抗生素治疗的发展。因此研究抗生素对志贺氏菌作用的分子机理和志贺氏菌致病机理具有较大的理论意义和应用价值。论文以福氏2a志贺菌301为材料,探究黄连素对福氏2a志贺菌301的作用机理,得到了以下主要结果:首先,在对数早期和平台早期的福氏2a志贺菌301培养物中分别添加160μg/mL浓度的黄连素,发现黄连素添加时间不同,作用效果不同。志贺氏菌在黄连素孵育情况下的存活率:对数期实验组为62.45 %,对数期对照组为152.6 %;平台期实验组为91.22 %,平台期对照组为93.01 %。可见黄连素在对数早期对志贺氏菌生长表型的影响大于在平台早期时的影响。应用双向电泳技术分析了添加160μg/mL浓度的黄连素后对福氏2a志贺菌301蛋白质表达谱的影响。结果表明,不同时期添加黄连素,对福氏2a志贺菌301蛋白质表达的影响也不尽相同,对数生长早期可引起9个蛋白质表达差异:谷氨酸脱羧酶B(GadB),谷氨酸脱羧酶A(GadA),高渗诱导周质蛋白(OsmY),超氧化物歧化酶前体(SodC)、细菌铁蛋白(Bfr),假想蛋白(YgiW),yhbH的sigma调节因子(YfiA),可能为Mxi-Spa途径分泌蛋白(OspC2)和假想蛋白(YqhE),它们均被下调;其中OsmY与细胞渗透压调控有关;GadB和GadA参与调节细胞抗酸性;OspC2与志贺氏菌毒力有关, SodC与细胞抗氧化胁迫有关。平台早期处理的引起3个蛋白质表达差异,其中上调的为:球面调节蛋白(Dps)和3-磷酸甘油醛脱氢酶A(GapA),下调的为:3-氧酰基还原酶(FabG)。有趣的是,谷氨酸脱羧酶(GadB)的表达量在黄连素处理后发生较大的变化,它可能在福氏2a志贺菌301致病中具有重要作用。继而,利用λ-Red重组系统构建了gadB缺失突变株,研究了GadB在豚鼠角膜侵袭中的可能作用。结果表明,gadB基因缺失株不能利用甘油作为碳源代谢,豚鼠角膜炎症反应稍轻于野生株。基因缺失导致其全菌蛋白表达谱出现10个差异蛋白,主要包括6个与能量和生物大分子代谢有关的蛋白质:葡糖磷酸异构酶(Pgi)、磷酸甘油酸激酶(Pgk)、葡萄糖酸激酶(Gntk)、琥珀酸脱氢酶(SdhB)、硫辛酰胺脱氢酶(LpdA)和L-乳酸脱氢酶(LldD)。2个应激性激活的蛋白质烷基氢过氧化物还原酶(AphF)和FK结合蛋白型肽酰-脯氨酰-顺反异构酶(FkpA)。上述发现的差异蛋白为GadB蛋白潜在功能的进一步研究提供了线索和可能性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
缩略表  7-5
目录  5-8
第一章绪论  8-14
  1.1 关于志贺氏菌  8
    1.1.1 志贺氏菌基本特性  8
    1.1.2 志贺氏菌的分类  8
  1.2 志贺氏菌的危害性和流行病学简述  8-9
  1.3 志贺氏菌的致病机理  9
  1.4 志贺氏菌谷氨酸依赖型抗酸系统相关基因的研究进展  9-10
  1.5 抗生素的作用机制  10-11
  1.6 细菌的耐药性  11-12
  1.7 研究目的、意义和研究内容  12-14
第二章材料和方法  14-26
  2.1 实验材料  14-15
    2.1.1 菌株和质粒  14
    2.1.2 主要仪器  14
    2.1.3 主要试剂  14-15
  2.2 培养基及相关试剂配制  15-17
    2.2.1 培养基及抗生素的配制  15
    2.2.2 DNA 电泳用琼脂糖凝胶的配制  15-16
    2.2.3 蛋白质组学相关溶液的配制  16-17
    2.2.4 生物素标记gadB 调控区DNA 磁珠捕获实验所用的溶液的配制  17
  2.3 菌株培养条件  17
  2.4 黄连素添加前后比较蛋白质组学的研究  17-20
    2.4.1 不同培养基中福氏2a 志贺菌301 野生株生长曲线的测定  17
    2.4.2 黄连素孵育  17
    2.4.3 黄连素孵育前后活菌计数  17-18
    2.4.4 黄连素孵育前后全菌蛋白的样品制备  18
    2.4.5 双向电泳  18-19
    2.4.6 扫描与分析  19
    2.4.7 胶内酶切  19-20
    2.4.8 MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定和数据库查询  20
  2.5 生物素标记gadB 调控区DNA 磁珠捕获蛋白双向电泳实验  20-21
  2.6 福氏志贺菌301ΔgadB 菌株的获得  21-23
  2.7 gadB 回复突变株的构建  23
  2.8 突变株与野生株生长状态的测定  23
  2.9 突变株与野生株生化特性比较  23-24
  2.10 豚鼠角膜侵袭实验（Sereny Test）  24
  2.11 突变株和野生株蛋白表达谱的比较研究  24-26
第三章结果与讨论  26-48
  3.1 黄连素添加条件下比较蛋白质组学的研究  26-35
    3.1.1 不同培养基中福氏2a 志贺菌301 野生株生长曲线的测定  26
    3.1.2 黄连素添加条件下活菌计数  26-27
    3.1.3 黄连素添加条件下全菌蛋白的双向电泳  27-29
    3.1.4 差异表达蛋白及其质谱鉴定结果  29-32
    3.1.5 黄连素添加实验分析  32-35
  3.2 生物素标记gadB 调控区DNA 磁珠捕获蛋白双向电泳实验  35-36
  3.3 gadB 缺失突变株的构建及验证  36-37
  3.4 gadB 回复株的构建及验证  37-38
  3.5 gadB 缺失突变株与野生株生长状态的测定  38-39
  3.6 gadB 缺失突变株与野生株生化特性比较  39-40
  3.7 gadB 缺失突变株与野生株豚鼠角膜实验（Sereny Test）比较  40-41
  3.8 gadB 缺失突变株、野生株和回复株蛋白表达谱的比较研究  41-48
    3.8.1 突变株、野生株和回复株双向电泳图谱  41-43
    3.8.2 差异表达蛋白质的质谱鉴定结果和分析  43-48
第四章结论与展望  48-49
  4.1 结论  48
  4.2 展望  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-54
附录1：硕士期间发表的学术论文  54

黄连素抑制福氏志贺菌的作用机理及GadB蛋白功能的研究

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