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桑叶有效部位降血糖作用与JNK信号通路的关系

作　者: 罗明琍
导　师: 吴新荣
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 桑叶 有效部位 2型糖尿病 JNK 信号通路
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目前,糖尿病(Diabetes Mellitus)已成为全世界许多国家的常见病和多发病,其死亡率已居肿瘤、心血管之后的第三位。我国糖尿病患者数量居全球首位,而其中约95%为2型糖尿病患者。因此糖尿病的治疗任务刻不容缓。胰岛β细胞功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是2型糖尿病发病的两个关键因素。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal Kinase, JNK)是有丝分裂原活化蛋白激酶[Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK)]超家族的重要一员,该家族还包括ERK和p38。JNK信号通路是参与糖尿病发病机制的重要通路。糖尿病状态下胰岛β细胞中,氧化应激能导致JNK激活,损害核内胰岛素信号通路,从而使胰岛素基因表达水平的降低,破坏胰岛素合成。此外,JNK的激活可使胰岛素受体底物IRS-1ser307位点磷酸化,导致胰岛素抵抗。桑叶及其有效成分已被报道具有良好的降低血糖作用,但其降血糖作用分子机制鲜见报道。JNK信号通路是涉及糖尿病发病的重要通路,桑叶对糖尿病的治疗作用,是否涉及到对此通路的调控作用?本文正是基于对此问题的思考而进行探索性实验研究。1.文献研究对与2型糖尿病相关的发病机制、中医药治疗2型糖尿病的现状进行了较全面的文献综述,为本研究的立题目的提供依据。主要从以下方面展开文献研究：1.糖尿病目前的流行情况、发病机制研究进展；2.中药及其有效成分治疗2型糖尿病的现状；3.桑叶有效成分及其降血糖作用、机制研究进展；4.JNK信号通路与2型糖尿病发病机制的重要关系研究进展；5. microRNA与2型糖尿病的研究进展。2.实验研究2.1桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响研究目的：建立2型糖尿病动物模型,研究桑叶总黄酮、桑叶总多糖、桑叶水提液分别对2型糖尿病大鼠血糖、血脂的影响。研究方法：SD大鼠随机分为正常对照组(NC组8只),糖尿病组,糖尿病组大鼠利用高脂高糖饲料喂养8周联合一次性腹腔注射STZ30mg·kg-1建立2型糖尿病大鼠模型,造模成功的大鼠随机分为模型对照组(DM组),桑叶总黄酮治疗组(MTF组,30mg·kg-’),桑叶总多糖治疗组(MTP组,100mg·kg-1),桑叶水提物治疗组(MWE组,6g·kg-1)和罗格列酮治疗组(RSG组,4mg·kg-1),每组10只。灌胃给药,每周称量大鼠体重、空腹血糖FBG,观察大鼠生存状态。连续给药6周后,麻醉大鼠腹主动脉取全血,测定大鼠血清游离脂肪酸NEFA、胆固醇CHO、甘油三脂TC含量。研究结果：①复制的2型糖尿病大鼠模型,与正常对照组大鼠相比较,表现出多饮多食、排泄增加、高血糖、高血脂症状,且后期体重减轻,符合2型糖尿病临床特点。②经过治疗6周,NC组大鼠体重呈直线上升；DM组大鼠体重显著下降,与NC组比较差异具显著性(P<0.01)；与DM组相比,MWE、MTP、MTF体重更重,差异具有显著性(P<0.01或0.05)。③MTF、MTP治疗第4周,MWE治疗第5周大鼠FBG开始下降,与未给药时相比具有显著差异(P<0.05)。④给药6周后,与NC组比较,DM组NEFA、TG、CHO均存在显著性差异(P＜0.05)。与DM组比较,MWE组TG、CHO降低(P<0.05), NEFA无显著差异(P>0.05)；MTF组TG、CHO、MDA均降低(P<0.05),NEFA无显著差异(P>0.05)；MTP组TG(P<0.05),NEFA、CHO无显著差异(P>0.05)；RSG组NEFA、TG、CHO无显著差异(P>0.05)。研究结论：建立的2型糖尿病模型符合实验要求；桑叶有效部位具有改善糖尿病大鼠生存状态、降低空腹血糖、且在降低血糖的同时降低血脂的作用,而罗格列酮具有良好的降血糖作用,无降血脂作用。桑叶各个不同有效部位在降血糖、改善血脂方面的作用表现不一。2.2桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织的作用及功能的影响研究目的：评价桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织的作用及胰岛细胞的功能影响。研究方法：采用先饲以高脂肪饲料联合一次性腹腔注射小剂量STZ,破坏部分胰岛β细胞的造模方法建立2型糖尿病大鼠模型,接着采用桑叶总黄酮MTF、桑叶总多糖MTP、桑叶水提液MWE治疗6周,干预过程、干预方法与实验2.1中相同。于第6周各组大鼠行灌胃葡萄糖耐量OGTT试验；随后麻醉大鼠腹主动脉取全血,Elisa法测定大鼠胰岛素INS含量；测定大鼠血清MDA、SOD含量；取胰岛组织,分别再行HE染色、透射电镜观察胰岛组织病理学形态变化。研究结果：①胰岛HE染色显示：模型组大鼠胰岛内β细胞所剩无几,几乎成空泡状,胰岛细胞萎缩,细胞核呈密集现象,胰腺损伤严重。MTF、MTP、MWE、RSG给药组胰岛细胞较模型组明显改善。②透射电镜结果显示正常对照组大鼠β细胞位于胰岛中央,胞质内有大量的、大小不一的分泌颗粒,颗粒内有大小、形状不同的致密核芯。颗粒的电子密度高低不等,颗粒外包以界膜,核芯与界膜之间有较宽的清亮间隙。胞质内有散在的线粒体,呈圆形或细长形。其余组β细胞胞核固缩,甚至不明显,核膜凹陷,分泌颗粒数量减少,空晕增宽,甚至界膜破裂,呈现不同程度的细胞损伤；③MWE组、MTF组、MTP组及RSG组在OGTT2h时,血糖水平均低于模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。④给药6周后,与NC组比较,DM组INS、MDA、SOD均存在显著性差异(P<0.05)。与DM组比较,MWE组INS、SOD升高(P<0.05),MDA无显著差异(P>0.05)；MTF组INS、SOD升高,MDA降低(P＜0.05)；MTP组INS、SOD升高,MDA降低(P<0.05)；RSG组INS、SOD升高,MDA降低(P<0.05)。研究结论：桑叶的各个有效部位均可增加糖尿病大鼠胰岛素分泌,对大鼠胰岛功能具有一定的修复作用。桑叶总黄酮、桑叶总多糖、桑叶水提液这三个部位之间作用没有显著差异,但从OGTT、血清胰岛素含量以及病理检查等数据看,桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛功能的影响更为明显。2.3桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1mRNA表达的影响研究目的：探索桑叶有效部位降血糖、保护胰岛功能的作用机制及其与JNK信号通路的关系,测定桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、 IRS-1mRNA表达的影响。研究方法：采用上述方法建立2型糖尿病模型并进行干预治疗后,取大鼠胰岛组织,提取RNA并进行纯度测定。Q-PCR测定大鼠胰岛组织JNK、AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达水平。研究结果：①与正常对照组相比较,模型组大鼠胰岛JNKmRNA的表达水平显著增加(P＜0.01),AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)；②与模型组比较：桑叶总多糖下调了JNKmRNA的表达(P<0.05),上调AKT、IRS-1mRNA的表达水平(P<0.01),对PDX-1mRNA的表达无显著影响；桑叶总黄酮能显著上调AKT、 PDX-1mRNA的表达(P<0.05),对IRS-1mRNA、JNKmRNA有一定的影响,但差异无显著性；桑叶水提液显著上调AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达(P<0.01),对JNKmRNA表达的影响无显著差异；③罗格列酮可以显著下调JNKmRNA的表达(P<0.05),上调AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达(P＜0.01)。研究结论：桑叶总黄酮、总多糖、水提液分别对JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、 IRS-1靶点具有不同程度的影响,它们产生降血糖作用以及保护胰岛组织、修复胰岛功能的分子机制涉及到了JNK信号通路。2.4桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1蛋白表达及磷酸化的影响研究目的：探索桑叶有效部位降血糖、保护胰岛功能的作用机制及其与JNK信号通路的关系,测定桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1蛋白表达及磷酸化水平的影响。研究方法：采用上述方法建立2型糖尿病模型并进行干预治疗后,取大鼠胰岛组织,切取一部分于10%的PBS缓冲液甲醛固定后,切片,免疫组化检测JNK、p-JNK的表达；另一部分提取总蛋白,Western blot法检测JNK, p-JNK(Thrl83/Tyrl85), AKT, ph-AKT ser473, IRS-1, p-IRS-lser307, PDX-1在胰岛组织中的表达。研究结果：免疫组化结果显示JNK、p-JNK在各组胰腺中具有不同程度的表达。Western blot结果显示：与正常对照组相比较,模型组JNK、IRS-1ser30蛋白磷酸化程度显著增加(P<0.01),Aktser473磷酸化减弱(P<0.01),PDX-1蛋白表达减弱(P<0.01)。与模型组相比较：①桑叶总多糖、桑叶总黄酮、桑叶水提液显著降低JNK(Thr183/Tyr185)、IRS-1ser30磷酸化水平(P＜0.01),提高PDX-1蛋白的表达(P<0.01),对Aktser473磷酸化水平无显著影响；②罗格列酮可以显著降低JNK(Thr183/Tyrl85)、IRS-1ser307磷酸化水平(P＜0.01),提高PDX-1蛋白的表达(P<0.01),提高Aktser473磷酸化水平(P＜0.05)。研究结论：桑叶总多糖、桑叶总黄酮、桑叶水提液均可降低JNK磷酸化水平,抑制JNK信号对大鼠胰岛组织的损伤。桑叶的降血糖、保护胰岛功能的作用涉及到了JNK信号通路。

全文目录


摘要  3-7
Abstract  7-17
前言  17-19
第一章 文献研究  19-33
  一、2型糖尿病及发病机制研究进展  19-22
    1. 2型糖尿的概念  19
    2. 2型糖尿病的发病机制  19-22
      2.1 2型糖尿病胰岛素抵抗  19-20
      2.2 2型糖尿病胰岛β细胞损伤  20-22
  二、中医药治疗2型糖尿病研究现状  22-27
    1. 单味中药降血糖研究现状  22-24
      1.1 多糖类  22-23
      1.2 皂苷类  23
      1.3 黄酮类  23-24
      1.4 生物碱类  24
      1.5 其他类化合物  24
    2. 复方或中药合用治疗糖尿病研究情况  24
    3. 中药治疗糖尿病的机制研究  24-25
    4. 讨论  25-27
  三、桑叶降血糖作用研究进展  27-30
    1. 桑叶降血糖有效成分研究  27-28
      1.1 桑叶黄酮类成分  27
      1.2 桑叶多糖类成分  27
      1.3 桑叶生物碱类成分  27-28
    2. 桑叶降血糖药理实验研究  28
    3. 桑叶降血糖机制研究概况  28-30
  四、JNK信号通路与2型糖尿病  30-32
    1. JNK信号通路概述  30
    2. JNK信号通路与胰岛素抵抗  30-31
    3. JNK信号通路与胰岛细胞损伤  31
    4. 药物通过影响JNK信号通路改善糖尿病的作用研究  31-32
  五、MicroRNA与2型糖尿病  32-33
第二章 实验研究  33-89
  一、桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响  33-44
    1. 材料  33-34
      1.1 实验动物及饲料  33
      1.2 药品与试剂  33-34
      1.3 主要仪器  34
    2. 实验方法  34-36
      2.1 药物的制备  34
      2.2 2型糖尿病模型的建立  34
      2.3 分组及干预措施  34-35
      2.4 样本的采集及指标测定  35
      2.5 统计方法  35-36
    3. 结果  36-41
      3.1 大鼠一般情况的观察  36
      3.2 各组大鼠体重变化情况  36-37
      3.3 桑叶各有效部位对大鼠糖脂代谢的影响  37-41
    4. 讨论  41-43
      4.1 2型糖尿病动物模型  41-42
      4.2 桑叶对2型糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响  42-43
    5. 小结  43-44
  二、桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织结构及功能的影响  44-60
    1. 材料  44-45
      1.1 实验动物及饲料  44
      1.2 药品与试剂  44-45
      1.3 主要仪器  45
    2. 实验方法  45-48
      2.1 2型糖尿病模型的建立  45
      2.2 分组及干预措施  45-46
      2.3 空腹葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)  46
      2.4 样本的采集  46
      2.5 Elisa法测定血清胰岛素含量  46-47
      2.6 血清丙二醛(Maleic Dialdehyde MDA)含量测定  47
      2.7 血清超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase SOD)含量测定  47
      2.8 HE染色  47-48
      2.9 电镜样品的制备  48
      2.10 统计学方法  48
    3. 结果  48-58
      3.1 给药6周后,大鼠口服糖耐量试验结果  48-50
      3.2 血清胰岛素含量测定结果  50-53
      3.3 桑叶不同有效部位对大鼠血清MDA、SOD的影响  53-55
      3.4 治疗6周后大鼠胰腺光镜下病理组织学检查结果  55
      3.5 治疗6周后大鼠胰腺电镜下病理组织学检查结果  55-58
    4. 讨论  58-59
    5. 小结  59-60
  三、桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织JNK、AKT、PDX-1、IRS-1 mRNA表达水平的影响  60-73
    1. 材料  60-62
      1.1 实验动物及饲料  60-61
      1.2 药品与试剂  61-62
      1.3 主要仪器  62
    2. 实验方法  62-66
      2.1 2型糖尿病模型的建立  62
      2.2 分组及干预措施  62-63
      2.3 样本的采集  63
      2.4 胰腺组织总RNA提取  63
      2.5 去基因组  63-64
      2.6 总RNA纯度和完整性检测  64
      2.7 mRNA逆转录反应  64-65
      2.8 Q-PCR反应  65-66
    3. 结果  66-71
      3.1 提取总RNA纯度检测  66
      3.2 荧光定量PCR各组扩增曲线、溶解曲线  66-68
      3.3 桑叶不同有效部位对大鼠胰腺中JNK、IRS-1、AKT、PDX-1mRNA表达的影响  68-71
    4. 讨论  71-72
    5. 小结  72-73
  四、桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织JNK信号通路关键蛋白表达及其磷酸化的影响  73-89
    1. 材料  73-76
      1.1 实验动物及饲料  73
      1.2 药品与试剂  73-75
      1.3 主要仪器  75-76
    2. 实验方法  76-81
      2.1 2型糖尿病模型的建立  76
      2.2 分组及干预措施  76
      2.3 样本的采集  76
      2.4 免疫组织化学法(IHC)  76-77
      2.5 胰腺组织中蛋白的提取  77
      2.6 胰腺组织中蛋白浓度测定  77-79
      2.7 Western Blot检测相关蛋白表达  79-80
      2.8 统计方法  80-81
    3. 结果  81-87
      3.1 蛋白含量测定标准曲线  81-82
      3.2 免疫组织化学法检测大鼠胰岛中JNK蛋白磷酸化水平  82
      3.3 Western blot检测桑叶不同有效部位对JNK蛋白表达及磷酸化的影响  82-84
      3.4 Western blot检测桑叶不同有效部位对IRS-1蛋白表达及磷酸化的影响  84-85
      3.5 Western blot检测桑叶不同有效部位对Akt蛋白表达及磷酸化的影响  85-86
      3.6 Western blot检测桑叶不同有效部位对PDX-1蛋白表达的影响  86-87
    4. 讨论  87-88
    5. 小结  88-89
全文总结及展望  89-90
参考文献  90-101
在校期间发表论文  101-102
致谢  102

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