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新疆鹰嘴豆中金属硫蛋白对铅毒性作用的干预研究

作　者: 于立博
导　师: 刘继文
学　校: 新疆医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 木垒县鹰嘴豆金属硫蛋白蛋白提取铅中毒预防
分类号: R29
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：鹰嘴豆是新疆地产药食兼用植物，也是维吾尔族居民喜爱食用的食物同时又是用于防治疾病的药物。木垒县是新疆鹰嘴豆的主产区，由于其得天独厚的原始自然环境，使得当地生产的鹰嘴豆品质优良，属天然绿色食品。为了提升鹰嘴豆的附加值以期对其进行功能性食品开发和药物资源利用，我们对其中的营养素及生物活性物金属硫蛋白进行了提取测定。在此基础上利用鹰嘴豆中提取的金属硫蛋白对铅毒性进行干预研究，从体内和体外观察了其防治铅毒性的效果，以期为铅防治提供一种新的方法。方法：1）采用原子吸收测定法对木垒县当年产鹰嘴豆籽粒中的金属元素进行了检测；采用氨基酸测定仪对鹰嘴豆中的氨基酸和蛋白质进行了检测；用硫酸锌水溶液对鹰嘴豆芽进行水培法孵育诱导豆芽中金属硫蛋白的生成；采用低温高速离心法和镉-血红蛋白包合法对鹰嘴豆籽粒及豆芽中的金属硫蛋白进行分离提取并测定含量。用高效液相色谱法对金属硫蛋白提取液进行初步提纯。对提纯的金属硫蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合MALDI-TOF-MS质谱分析法对其氨基酸序列进行分析。2）选择昆明种幼鼠，建立铅中毒模型，用鹰嘴豆-金属硫蛋白进行干预研究，通过HE染色观察肝、肾组织的病理改变，使用透射电镜观察了肾脏组织的超微结构改变，用化学显色法及原子吸收法检测了肝、肾、血清中SOD、GSH-Px、MDA的含量及肝、肾、脑、骨骼组织中铅离子的含量，用酶联免疫法检测了组织中金属硫蛋白含量改变。并通过RT-PCR观察了外源性金属硫蛋白对MT1-EmRNA和MT2AmRNA表达的影响。采用单细胞凝胶电泳法观察了外源性金属硫蛋白对铅所致淋巴细胞DNA损伤的修复作用。3）体外培养淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓间充质细胞，通过预实验所得半数抑制浓度，确定染铅浓度，建立细胞铅中毒模型后给予外源性金属硫蛋白干预，观察鹰嘴豆-金属硫蛋白体外拮抗铅毒性的效果。采用酶联免疫法测定了三种细胞培养液中乳酸脱氢酶含量；采用原子吸收法测定了细胞内钾离子，钙离子和铅离子的含量；采用BCA法测定了细胞中总蛋白含量；采用流式细胞术检测了淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓基质细胞凋亡情况；采用Hoechest33258荧光染色观察了淋巴细胞凋亡情况；采用透射电镜观察了淋巴细胞的超微结构改变；采用荧光免疫方法观察了海马神经元细胞和骨髓基质细胞的Bcl-2和Bax表达情况。结果：1）木垒县产鹰嘴豆中含有17种氨基酸，氨基酸总和达到18.8%，其中人体必需氨基酸全部包含在内。含有人体所需的多种矿物质：钾、铬、钙、铁、锌、铜、镁、铬等，其中钾、镁、钙的含量最高，分别达到了9256.5mg/kg、1289mg/kg和1074.0mg/kg，重金属铅含量未检出，镉含量为5.9ug/kg，总汞含量为2.58ug/kg，总砷含量为4.1ug/kg。鹰嘴豆籽粒中金属硫蛋白含量为：0.16mg/g，鹰嘴豆芽中金属硫蛋白含量为：0.356mg/g。鹰嘴豆-金属硫蛋白的分子量约为10KD。对基质辅助激光解吸-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析结果在NCBI BLAST中进行检索，共检索出有匹配肽段的蛋白96个，根据等电点和分子质量范围筛选出符合条件的蛋白两个gi|330253730和gi|355496648，与这两个蛋白质中匹配上的肽段共有17条。2）动物实验结果显示，染铅后幼鼠的进食量、饮水量及活动量明显减少。HE染色后光镜下观察可见，染铅后小鼠肝、肾组织细胞排列紊乱，组织细胞水肿，给予金属硫蛋白干预后明显好转。透射电镜下观察，可见阳性染铅组小鼠肾小管上皮细胞核固缩，细胞边缘化，细胞内线粒体大量空泡变，微绒毛排列紊乱，内质网及溶酶体增加，线粒体基质膜肿胀，干预组尤其是高剂量干预组细胞损伤状况减轻，细胞内空泡减少，微绒毛排列相对整齐。肝脏、肾脏、血清过氧化指标检测结果显示，阳性对照组的GSH-Px和SOD含量降低，干预后GSH-Px和SOD含量升高，差别有统计学意义（P＜0.05）；阳性对照组的MDA含量上升，各干预组MDA含量降低，其差别有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较，高剂量干预组巯基含量增加，其差别有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较，高、中剂量组的肝脏、肾脏、脑、骨骼、全血组织中铅离子含量降低，其差别有统计学意义（P＜0.05）；与阴性对照组比较，各干预组金属硫蛋白含量升高，其差别具有统计学意义（P＜0.05）；单细胞凝胶电泳结果显示，鹰嘴豆-金属硫蛋白对铅所致淋巴细胞DNA损伤有修复作用，使细胞DNA损伤程度减轻，产生彗星细胞数目减少；RT-PCR结果显示，染铅后阳性组小鼠肝脏MT1-EmRNA和MT2AmRNA表达量增加，给予金属硫蛋白干预后各组MT1-EmRNA和MT2AmRNA表达量降低（P＜0.05）；染铅后阳性组小鼠肾脏MT1-EmRNA和MT2AmRNA表达量增加，给予金属硫蛋白干预后各组MT1-EmRNA和MT2AmRNA表达量降低（P＜0.05）。3）细胞实验结果显示，染铅后淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓基质细胞增殖率降低，给予鹰嘴豆-金属硫蛋白干预后，各组细胞的增值率升高。染铅后阳性组淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓基质细胞中铅离子含量增加，给予外源性金属硫蛋白干预后，高、中剂量组细胞中铅离子含量显著降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；24小时、48小时和72小时淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓基质细胞的染铅阳性组细胞中钾离子含量升高，给予外源性金属硫蛋白干预后，高剂量干预组细胞中的钾离子含量降低，差别有统计学差异（P＜0.05）；24小时、48小时和72小时淋巴细胞、海马神经元细胞和骨髓基质细胞的染铅阳性组细胞中钙离子含量升高，给予外源性金属硫蛋白干预后，48小时和72小时高、中剂量组细胞的钙离子含量降低，有统计学差异（P＜0.05）；24小时、48小时和72小时染铅后各组细胞培养液中的乳酸脱氢酶含量显著升高，给予金属硫蛋白干预后高、中剂量组细胞中LDH含量降低（P＜0.05）；Hoechest33258荧光染色结果显示染铅阳性组淋巴细胞凋亡率高于各干预组；透射电镜下观察到淋巴细胞染铅后，出现了凋亡小体，细胞间接触消失，细胞表面绒毛消失，当干预后尤其是高剂量干预组细胞损伤程度减轻，细胞表面绒毛又出现，细胞膜结构完整；染铅后海马神经元细胞和骨髓基质细胞的Bax表达量增加，给予金属硫蛋白干预后Bax表达量下降；染铅阳性组细胞的Bcl-2含量降低，给予外源性金属硫蛋白干预后Bcl-2含量上升。海马神经元细胞和骨髓基质细胞染铅阳性组bcl-2/bax降低，高剂量干预组bcl-2/bax升高（P＜0.05）。流式细胞术结果显示，染铅后海马神经元细胞和骨髓基质细胞凋亡率增加，给予金属硫蛋白干预后，细胞凋亡率降低。结论：新疆木垒县产鹰嘴豆中含有人体必需的氨基酸和矿物质，不含有重金属铅，总汞含量远远低于国家规定的食品容许量（0.02mg/kg），镉含量远远低于日本规定的糙米容许含量（1.0mg/kg）和德国规定的酒中镉容许量（0.1mg/kg），总砷含量远远低于国家规定的原粮容许含量（0.7mg/kg）；采用从鹰嘴豆中提取的金属硫蛋白对染铅幼鼠和染铅细胞进行干预实验，综合评价鹰嘴豆-金属硫蛋白拮抗小鼠铅毒性效果，证明鹰嘴豆-金属硫蛋白无论是在体内状态还是体外状态都能够拮抗铅毒性；通过本次研究，为今后进行鹰嘴豆的保健食品及功能食品开发提供了理论依据，同时为防治儿童铅中毒提供了一种新方法。

全文目录

摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-20
第一部分新疆木垒县产鹰嘴豆中营养素及金属硫蛋白提取测定  20-49
  1 材料与方法  22-25
    1.1 实验材料  22
    1.2 实验方法  22-25
    1.3 质量控制  25
    1.4 结果分析  25
  2 结果  25-41
  3 讨论  41-47
  4 小结  47-49
第二部分鹰嘴豆-金属硫蛋白对铅毒性作用的体内干预研究  49-82
  1 材料与方法  51-59
    1.1 仪器与试剂  51
    1.2 实验方法  51-58
    1.3 质量控制  58
    1.4 统计分析  58-59
  2 结果  59-74
  3 讨论  74-81
  4 小结  81-82
第三部分鹰嘴豆-金属硫蛋白对铅毒性作用的体外干预研究  82-124
  1 材料与方法  83-91
    1.1 仪器与试剂  83
    1.2 实验方法  83-90
    1.3 质量控制  90-91
    1.4 统计分析  91
  2 结果  91-116
  3 讨论  116-122
  4 小结  122-124
全文总结  124-126
致谢  126-127
参考文献  127-138
综述  138-153
  参考文献  146-153
攻读博士学位期间获得的学术成果  153-155
个人简历  155-156
导师评阅表  156

新疆鹰嘴豆中金属硫蛋白对铅毒性作用的干预研究

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