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淡色库蚊酚氧化酶proPOA3基因克隆及其与溴氰菊酯抗性关系的研究

作　者: 周丹
导　师: 朱昌亮
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 淡色库蚊 溴氰菊酯 杀虫剂抗性 酚氧化酶 基因突变
分类号: R184
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


蚊可传播疟疾、登革等多种疾病(蚊媒病),严重危害人类健康。化学防制一直是蚊媒综合治理的主要方法。杀虫剂大量、持续使用导致了蚊抗药性的发生和发展。目前,杀虫剂抗性已成为蚊媒病防制工作的最大障碍。抗药性是由基因决定的,发现和研究蚊媒杀虫剂抗性相关基因及其作用机制,有助于阐明抗药性的分子基础和治理抗药性。本实验前期研究从淡色库蚊(Culex pipiens pallens)溴氰菊酯敏感和抗性品系中分离、鉴定出多个表达差异序列,其中包括酚氧化酶原亚单位A3(prophenoloxidase subunit A3,proPOA3).在此基础上,本研究采用RT-PCR以及cDNA末端快速扩增(rapid amplification o f cDNA end,RACE)技术扩增淡色库蚊proPOA3基因；在细胞水平通过转染方法,研究proPOA3高表达对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响；随后通过实时定量PCR法鉴定了proPOA3基因在溴氰菊酯不同抗性水平蚊中的差异表达;最后应用PCR、基因序列分析等方法研究proPOA3基因点突变与溴氰菊酯表型的关系。本研究的主要结果如下：本研究获得的淡色库蚊proPOA3全长序列共2349bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为2061bp,编码686个氨基酸(GeneBank登录号：FJ755838.1,2009)。序列分析显示,该基因在物种中保守性较高,推导的氨基酸序列与已报道致倦库蚊(Cx.quinquefasciatus)的proPOA3具有98%同源性,并具有经典的酚氧化酶含铜中心结构,表明该基因为淡色库蚊proPOA3.构建淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体并转染蚊细胞,CCK-8检测发现,在高浓度溴氰菊酯(101.5μg/ml和102.0μg/ml)作用下,proPOA3转染组的存活率低于对照组(p<0.05),即高表达proPOA3后蚊细胞对溴氰菊酯的敏感性增强,提示proPOA3基因可能参与溴氰菊酯抗性的形成,为1个新的蚊抗药性相关基因。实时定量PCR结果显示,淡色库蚊proPOA3基因在无锡、南京、唐口和禹城4地现场自然种群溴氰菊酯敏感组中均高表达,分别为抗性组的2.60倍、6.33倍、4.33倍和5.02倍(均p<0.05)。对其它蚊种现场自然种群的进一步分析表明,proPOA3在三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhynchus)溴氰菊酯敏感组中是抗性组的5.03倍(p<0.05),但在中华按蚊(A nopheles. sinensis)和微小按蚊(An. minimus)的敏感组、抗性组之间无显著性差异(均p>0.05)。此外,在实验室淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选试验中,发现proPOA3的转录水平随着溴氰菊酯抗性水平(LCso)的增加而降低,两者具有显著负相关性(p<0.05)。本结果进一步验证proPOA3基因的表达与库蚊溴氰菊酯抗性负相关,提示该基因可望作为库蚊拟除虫菊酯抗性现场检测的分子靶标,值得进一步研究。对proPOA3的基因型分析提示,淡色库蚊存在2个突变位点、3种突变型(769G>A、1116G>C和1116G>A)。769G>A属于非同义突变(non-synonymous mutation),导致缬氨酸突变为异亮氨酸；1116G>C和1116G>A属于同义突变(synonymous mutation),相应位置氨基酸未发生变化。其中,769G>A和1116G>C突变是同时出现的,当769位碱基发生纯合突变(G/G→A/A)时,1116位碱基也为纯合突变(G/G→C/C)；当769位碱基为杂合突变(G/G→G/A)时,1116位碱基也为杂合突变(G/G→G/C)。青岛、微山、南京、无锡和淮北5地自然种群淡色库蚊经生物测定后,分别检测上述突变在敏感品系和抗性品系中的频率。769G>A(1116G>C)突变在抗性品系中的频率分别为：42.86%(青岛)、11.54%(微山)和23.92%(南京),均显著高于敏感品系：5.56%(青岛)、0%(微山)和0%(南京),该突变在无锡和淮北敏感、抗性品系中却均未被检测出。1116G>A突变只在无锡自然种群中被检测出,其中抗性种群为13.64%,敏感种群为9.52%,无显著性差异(p>0.05)。淮北自然种群未检测出上述3种突变。在实验室溴氰菊酯逐代筛选蚊实验中,发现769G>A(1116G>C)突变频率随着溴氰菊酯剂量增加呈规律性增加趋势,两者具有显著正相关性(p<0.05)；而1116G>A突变在第14代检测时则已消失。以上实验结果提示,在溴氰菊酯抗性的发生、发展过程中,769G>A(1116G>C)突变可能具有重要作用,而1116G>A突变可能与溴氰菊酯抗性不相关或不直接相关,均有待进一步研究。本研究首次报告了淡色库蚊proPOA3全长序列,发现proPOA3为1个新的蚊抗药性相关基因,存在2个突变位点、3种突变型,研究结果为阐明抗药性分子机理和治理抗药性提供了科学依据,具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。

全文目录


中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-17
第一部分 淡色库蚊proPOA3基因克隆与鉴定  17-36
  材料与方法  17-28
    1 材料  17-18
      1.1 供试蚊  17
      1.2 主要试剂  17-18
      1.3 主要仪器  18
    2 方法  18-28
      2.1 淡色库蚊proPOA3克隆  18-27
      2.2 生物信息学分析  27-28
  结果  28-34
    1 淡色库蚊proPOA3克隆  28-30
      1.1 淡色库蚊RNA的提取及鉴定  28
      1.2 淡色库蚊proPOA3基因ORF序列扩增  28-29
      1.3 淡色库蚊proPOA3基因5’端以及3’端序序列扩增  29-30
      1.4 淡色库蚊proPOA3基因全长序列拼接  30
    2 淡色库蚊proPOA3基因生物信息学分析  30-34
      2.1 淡色库蚊proPOA3基因序列分析  30
      2.2 淡色库蚊proPOA3基因同源性分析  30-33
      2.3 淡色库蚊proPOA3基因进化树分析  33
      2.4 淡色库蚊proPOA3基因编码蛋白结构域分析  33-34
  讨论  34-36
第二部分 淡色库蚊proPOA3基因高表达对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响  36-55
  材料与方法  36-49
    1 材料  36-37
      1.1 供试蚊及细胞系  36-37
      1.2 主要试剂  37
      1.3 主要仪器  37
    2 方法  37-49
      2.1 淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体构建  38-41
      2.2 淡色库蚊proPOA3瞬时转染对蚊细胞溴氰菊酯敏感性测定  41-43
      2.3 瞬时转染效率鉴定  43-49
  结果  49-52
    1 淡色库蚊proPOA3昆虫表达载体构建  49-50
    2 ProPOA3瞬时转染鉴定  50-51
      2.1 RT-PCR鉴定  50
      2.2 Western blot鉴定  50-51
    3 淡色库蚊proPOA3 高表达后蚊细胞对溴氰菊酯敏感性的变化  51-52
  讨论  52-55
第三部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊种群中的表达分析材料与方法  55-67
  材料与方法  55-61
    1 材料  55-56
      1.1 供试蚊  55-56
      1.2 主要试剂  56
      1.3 主要仪器  56
    2 方法  56-61
      2.1 淡色库蚊现场自然种群proPOA3的表达分析  56-58
      2.2 三带喙库蚊、中华按蚊和微小按蚊现场自然种群proPOA3的表达分析  58-59
      2.3 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3的表达分析  59-61
  结果  61-65
    1 ProPOA3在淡色库蚊自然种群敏感、抗性组中的表达差异  61
    2 ProPOA3在不同蚊种自然种群敏感、抗性组中的表达差异  61-62
    3 ProPOA3 在淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群中的表达差异  62-65
      3.1 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群的实验室选育  62
      3.2 ProPOA3在淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群中的表达变化  62-65
  讨论  65-67
第四部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊种群中的基因多态性分析  67-78
  材料与方法  67-71
    1 材料  67-68
      1.1 供试蚊  67-68
      1.2 主要试剂  68
      1.3 主要仪器  68
    2 方法  68-71
      2.1 淡色库蚊自然种群proPOA3基因的多态性分析  68-70
      2.2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因的多态性分析  70-71
  结果  71-75
    1 淡色库蚊自然种群proPOA3基因多态性检测  71-72
      1.1 单蚊基因组DNA提取  71
      1.2 淡色库蚊自然种群proPOA3基因多态性  71-72
    2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因多态性检测  72-75
      2.1 单蚊基因组DNA提取  72
      2.2 淡色库蚊溴氰菊酯逐代筛选种群proPOA3基因多态性变化  72-75
  讨论  75-78
参考文献  78-89
综述  89-103
  参考文献  98-103
攻读学位期间发表文章情况  103-104
致谢  104

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 流行病学与防疫 > 防疫措施和管理
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