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围产期低剂量氯化三丁基锡暴露对子代雄性小鼠的内分泌干扰作用及其机制初探

作　者: 辛全兵
导　师: 李杰; 司纪亮
学　校: 山东大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 氯化三丁基锡内分泌干扰作用围产期芳香酶甲基化
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景有机锡化合物(Organotin compounds, OTs)广泛用于船舶表面防生物附着涂料、杀虫剂、防腐剂(木材、纤维及皮革)、工业杀菌剂、塑料制品稳定剂等。由于应用广泛、环境中残存时间长,OTs已对全球环境(尤其是水体)造成了严重的污染。三丁基锡(Tributyltin, TBT)是OTs中最重要的一种,被认为是迄今为止由人为因素大量引入海水环境中最毒的化学品之一。它是一种确定的内分泌干扰物(ED),已有研究显示TBT对哺乳动物可产生免疫毒性、神经毒性、生殖毒性等。但这些研究所采用的染毒剂量都较大,而许多研究表明ED的危害并不呈线性剂量-反应关系,低剂量时的危害有可能要高于其高剂量时的危害。我们课题组的前期研究发现围产期低剂量氯化三丁基锡(TBTCl)暴露可导致子鼠睾丸中雌激素水平紊乱,附睾中精子数量减少及精子活度降低,睾丸组织出现病理性变化,并伴随着芳香酶含量的下降。目前又(?)TBTCl导致子代雄性小鼠发生以上变化的机制并不清楚,本研究在前期研究的基础上以子代雄性小鼠为主要研究对象,并添加己烯雌酚(DES)组作为阳性对照,对TBTCl影响妊娠结果、子鼠性发育及身体发育和血清中激素水平及其机制在分子和基因水平上做初步的探索。为研究TBTCl对人类的内分泌干扰作用及作用机制提供参考和借鉴。研究目的：探讨围产期低剂量TBTCl暴露对妊娠结果、子鼠发育和血清中激素水平的毒性作用,并且对其作用机制做初步的探索。研究方法：将受孕的KM小鼠随机分为阴性对照组(玉米油)、10、100μg/kgTBTCl组和阳性对照组(5μg/kg DES),每组6只。母鼠妊娠第6天(GD6)起,经口灌胃染毒,每天在同一时间染毒1次,染毒剂量为1ml/kg,直到哺乳期结束,即子鼠出生第21天(Postnatal day, PND21)。GD0、GD6、PND1和PND21时称量母鼠体重,染毒后开始观察并记录母鼠的流产及死亡情况；母鼠生产后,观察并记录出生子鼠的数量及雌雄比例,观察死亡情况并记录每组子鼠在哺乳期死亡的数量。PNDO、1、2、3、4、6、7、14和21时称量雄性子鼠体重,测量其肛门与生殖器之间的距离(AGD)。PND6时开始观察长毛情况,PND7时开始观察门牙萌生情况,PND12时开始观察睁眼情况,PND13时开始观察睾丸下降情况及PND28时开始观察包皮分离情况并分别记录其日龄。PND22和100时每组随机抽取10只雄性子鼠(阳性对照取8只),称重后摘眼球取血,离心取血清并保存；分离睾丸、附睾、脑、肝脏、脾脏、肾脏和胸腺(PND100时还取腹侧前列腺、精囊),并称重；将睾丸立即放入液氮中速冻并置于-80℃保存。应用酶联免疫吸附试验方法测定PND22和PND100雄性子鼠血清中雌激素(E2)、睾酮(T)、游离睾酮(F-T)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)的浓度。采用Real-time PCR法检测PND22子代小鼠睾丸组织中Cypllal、Cyp17a、 Hsd3b2、Hsdl7b3和CyP19五个基因mRNA相对表达量,并用亚硫酸盐直接测序法(BSP)检测调控芳香酶表达的cAMP反应元件结合蛋白、泛素/蛋白酶体亚基α2和雌激素受体β基因启动子区域CpG岛的甲基化情况。研究结果剂量组孕鼠的流产(死亡)率与阳性对照组相比显著降低,与阴性对照组相比有增加的趋势；100μg/kg TBTC1组母鼠在PND21时体重较对照组均显著增加,PND1-21(?)PGD0-PND21母鼠体重增加量与对照组相比均显著增加,GD6-PND21母鼠体重增加量较阴性对照组显著升高；剂量组子鼠的数量较对照组有下降的趋势；100μg/kg TBTCl组和阳性对照组幼鼠死亡数与阴性对照组相比均显著增加,而阳性对照组和100ug/kg TBTCl组幼鼠死亡数相比没有统计学意义。剂量组睾丸下降时间与阳性对照组相比显著提前,而与阴性对照组相比没有差异,阳性对照组与阴性对照组相比显著延迟。PNDO、1时100μg/kg TBTCl组的NAGD较阴性对照组显著降低,体重显著升高；PND3、6、14和21时TBTCl组NAGD与对照组相比有降低的趋势。PND0、1、2、6、7和21时100μg/kg组体重与阴性对照组相比显著增加,PND4-6、PNDO-7、PND14-21、PNDO-21的体重增加量与阴性对照组相比均显著增加。PND22时100μg/kg组睾丸脏器系数较对照组均显著降低；剂量组肝脏脏器系数与对照组相比均显著降低,脾脏重量及脏器系数与对照组相比显著增加,肾脏重量及脏器系数与阴性对照组相比显著增加。PND100时TBTCl组睾丸重量与阴性对照组相比显著升高,而与阳性对照组相比则显著降低；100μg/kg组精囊脏器系数与阴性对照组相比显著降低,肝脏脏器系数与阴性对照组相比显著升高；胸腺脏器系数与阴性对照组相比显著降低,与阳性对照组相比则显著升高。子代雄性小鼠血清中激素测量结果显示,PND22时100μg/kg组的E2和FSH浓度与对照组相比均显著降低；PND100时100μg/kg组血清中E2的水平与阴性对照组相比仍显著降低,而与阳性对照组相比则没有差异,阳性对照组血清中E2的水平与阴性对照组相比也显著降低。PND22子代雄性小鼠睾丸组织中类固醇激素合成途径关键酶mRNA(?)目对定量结果显示,10μg/kg组Cyp17a基因mRNA表达量与对照组相比均显著升高,Hsd3b2基因mRNA表达量与阴性对照组相比显著升高,而与阳性对照组相比则没有统计学差异；100μg/kg组Hsd17b(?)基因和(?)Cyp19(?)基因mRNA表达量与阴性对照组相比显著降低,剂量组Cyp19基因mRNA表达量有降低的趋势,而与阳性对照组相比则没有统计学差异；阳性对照组Hsd17b(?)基因和Cyp19(?)基因的mRNA表达量与阴性对照组相比有降低的趋势,但是没有统计学差异；Cypllal基因在各染毒组中mRNA表达量与对照组相比均无统计学差异。PND22子代雄性小鼠睾丸组织中甲基化克隆测序结果发现只有cAMP反应元件结合蛋白(CREB)启动子区域基因序列发生甲基化改变,而泛素/蛋白酶体亚基α2和雌激素受体β基因启动子区域序列未发现甲基化情况。结论围产期低剂量TBTCl暴露导致母鼠流产增多、导致肥胖及食仔,导致雄性子鼠出现雌性化的趋势,并影响子鼠生长和器官发育。TBTCl可通过影响CREB启动子区域基因序列发生甲基化,类固醇激素合成途径中关键酶mRNA的表达水平改变,而导致血清中激素水平紊乱。

全文目录

中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-16
符号说明  16-18
前言  18-22
第一节围产期低剂量TBTCl暴露对母鼠及妊娠结果的影响  22-28
  1 材料与方法  22-23
  2 实验结果  23-25
  3 讨论  25-27
  4 小结  27-28
第二节围产期低剂量TBTCl暴露对子代雄性小鼠生长发育的影响  28-43
  1 材料与方法  28-30
  2 实验结果  30-36
  3 讨论  36-42
  4 小结  42-43
第三节围产期低剂量TBTCl暴露对子代雄性小鼠血清中激素水平的影响  43-49
  1 材料和方法  43-45
  2 实验结果  45-46
  3 讨论  46-48
  4 小结  48-49
第四节围产期低剂量TBTCl暴露对PND22子鼠睾丸组织中类固醇激素合成途径关键酶mRNA表达水平的影响  49-59
  1 材料和方法  50-55
  2 实验结果  55-56
  3 讨论  56-58
  4 小结  58-59
第五节围产期低剂量TBTCl暴露对PND22子鼠睾丸组织中调控芳香酶表达的作用元件基因甲基化情况的影响  59-72
  1 材料和方法  60-67
  2 实验结果  67-68
  3 讨论  68-71
  4 小结  71-72
参考文献  72-80
附录  80-82
致谢  82-83
攻读硕士期间发表的论文  83-84
附件  84

围产期低剂量氯化三丁基锡暴露对子代雄性小鼠的内分泌干扰作用及其机制初探

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