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水/离子液体两相体系中全细胞转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸的研究

作　者: 陈金燕
导　师: 李春
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化工
关键词: 离子液体 全细胞 甘草酸 β-葡萄糖醛酸苷酶 化学键选择性 单葡萄糖醛酸甘草次酸 两相体系
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


利用生物法对天然产物进行改性以获得更具价值的化合物已成为生物化工和医药产业的研究热点。甘草酸改性得到单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)在体内更具有良好的溶解度和跨膜转运能力,且甜度高、热量低、更加安全等特性,使得GAMG具有更加广阔的应用前景。课题组前期分离筛选出一株产紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3,能够转化甘草酸定向生成GAMG,并克隆了其表达p-葡萄糖醛酸苷酶的基因Pgus,构建了β-葡萄糖醛酸苷酶的原核E.coli和真核P.pastoris表达系统,获得了三种不同转化类型的菌体。针对生物转化反应中底物甘草酸不易溶于水,甘草酸在水相中转化效率低等问题,本论文尝试在含离子液体体系中利用微生物全细胞为催化剂,转化甘草酸生成GAMG,并与纯水相、非水有机溶剂相体系进行比较,建立了含离子液体反应介质体系的全细胞转化模型,考察离子液体对全细胞转化甘草酸反应条件及选择性的影响,并对其如何影响β-葡萄糖醛酸苷酶的催化特性及结构和功能做初步探究。研究结果如下：(1)全细胞催化剂和反应介质的筛选：确定了产紫青霉P.purpurogenum Li-3 (w-PGUS)、重组毕赤酵母P. pastoris(r-PGUS-P)和重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(r-PGUS-E)三种全细胞最佳的收获时间,分别为诱导产酶72、48和6 h,此时对应的全细胞酶活力分别为1360、1102和428 U·kg-1。研究了上述三种全细胞在12种非水介质中转化甘草酸生成GAMG的反应,结果表明所选的疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Bmim]PF6)的生物相容性最好,全细胞w-PGUS和r-PGUS-P表现出了较好的催化效果。(2)全细胞w-PGUS在水／[Bmim]PF6两相体系中转化甘草酸生成GAMG的反应：确定了全细胞酶w-PGUS催化生成GAMG的最佳反应条件为,离子液体与水配比为1：1,pH 5.2,反应温度30℃,细胞密度60 g·L-1。在以上条件下,反应60 h产物GAMG得率为87.63%。为了提高全细胞操作稳定性,经固定化载体的初步筛选,选择海藻酸钠固定化载体对全细胞w-PGUS进行固定化,考察了固定化w-PGUS细胞在水/[Bmim]PF6两相介质体系中转化甘草酸生成GAMG的反应,并与缓冲液单相体系作为对照。系统地考察了一些因素,如离子液体浓度、缓冲液pH、反应温度、底物浓度等对该反应的影响。确定了在水/[Bmim]PF6两相体系中,最适离子液体加入比例、缓冲液pH、反应温度、底物浓度分别为10%、5.8、35℃和6.0mmol·L-1。而在缓冲液单相体系中,缓冲液pH、反应温度、底物浓度分别为5.0、35℃和3.6mmol·L-1。离子液体的添加在一定程度上提高了甘草酸转化率和反应体系pH和温度稳定性。固定化细胞在水/[Bmim]PF6两相体系中重复利用3次后,甘草酸转化率仍能维持在77.36%,细胞固定化后有助于细胞操作稳定性的提高。(3)重组毕赤酵母r-PGUS-P全细胞在水/[Bmim]PF6两相体系中转化甘草酸生成GAMG的反应：确定[Bmim]PF6与水最适配比为2：8(v/v),最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度和细胞加入量分别为5.4、45℃、6.0mmol·L-1和8.0 g·L-1。在此条件下反应58 h,产物GAMG得率和化学键选择性(Scb)分别为69.6%和67.2%,与纯水相反应体系相比,分别提高了12.4%和12.61%。离子液体循环使用7次后,回收利用率为93.47%。产物和副产物在此两相体系中得到有效分离,为后续产物分离纯化带来便利。(4)离子液体对p-葡萄糖醛酸苷酶催化特性及结构和功能的影响。考察离子液体对p-葡萄糖醛酸苷酶催化反应特性的影响。结果表明,水/[Bmim]PF6两相体系中最适底物4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)为10.0 mmol·L-1,较缓冲液单相体系提高了1倍,确定了该体系动力学与热力学参数,Vmax为0.153 mmol·L-1·min-1,Km为0.620 mmol·L-1,表观活化能Ea为35.386 KJ·moL-1。而缓冲液单相反应体系中Vmax为0.094 mmol·L-1·min-1,Km为0.773 mmol·L-1,Ea为48.199 KJ·moL-1,离子液体[Bmim]PF6降低了反应活化能并提高了反应速率。说明疏水性离子液体[Bmim]PF6对酶的催化行为有较大的影响。通过荧光光谱和圆二色谱法分析离子液体对β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白的影响,研究表明离子液体处理诱导了酶蛋白分子伸展和二级结构的改变,a螺旋结构减少β折叠增加。推测原因为离子液体能够促使酶构型发生转变,疏水性离子液体可使蛋白质周围微环境中水分减少导致酶构象向着刚性结构演变,这是导致酶催化特性改变的关键。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略词表  9-10
目录  10-13
前言  13-14
第1章 文献综述  14-24
  1.1 天然产物的生物转化  14-18
    1.1.1 甘草酸生物转化生成单葡萄糖醛酸甘草次酸  14-17
    1.1.2 非水介质中的生物转化  17-18
    1.1.3 非水介质中微生物细胞转化  18
  1.2 离子液体  18-22
    1.2.1 离子液体简介  18-19
    1.2.2 离子液体在生物催化中的应用  19-21
    1.2.3 离子液体对酶化学结构的影响  21
    1.2.4 离子液体应用前景  21-22
  1.3 论文研究的意义和技术框架  22-24
    1.3.1 论文研究的意义  22-23
    1.3.2 技术框架  23-24
第2章 材料与方法  24-32
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 培养基  24-25
    2.1.3 药品及试剂  25-26
    2.1.4 仪器  26
  2.2 方法  26-32
    2.2.1 全细胞酶活力的测定方法  26-27
    2.2.2 β-葡萄糖醛酸苷酶活力的测定方法  27
    2.2.3 蛋白质浓度的测定  27-28
    2.2.4 GL、GAMG及pNP标准曲线的绘制  28-29
    2.2.5 细胞固定化方法  29-30
    2.2.6 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  30
    2.2.7 重组大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化过程  30
    2.2.8 Ni-NTA Sepharose亲和层析  30-31
    2.2.9 高效液相色谱分析  31
    2.2.10 荧光光谱分析  31
    2.2.11 圆二色谱分析  31-32
第3章 甘草酸转化反应中非水介质和全细胞催化剂的筛选  32-39
  引言  32
  3.1 确定全细胞收获的最佳时间  32-35
    3.1.1 收集全细胞w-PGUS的最佳时间  33-34
    3.1.2 收集全细胞r-PGUS-P的最佳时间  34
    3.1.3 收集全细胞r-PGUS-E的最佳时间  34-35
  3.2 非水介质和全细胞的筛选  35-37
  3.3 非水介质中全细胞的相对活性  37-38
  3.4 小结  38-39
第4章 水/离子液体两相体系中产紫青霉Li-3全细胞转化甘草酸  39-49
  引言  39
  4.1 游离w-PGUS细胞在[Bmim]PF_6/水两相体系中的催化反应  39-42
    4.1.1 离子液体的添加比例对转化反应的影响  39-40
    4.1.2 缓冲液pH对w-PGUS转化反应的影响  40-41
    4.1.3 反应温度对w-PGUS转化反应的影响  41-42
    4.1.4 全细胞加入量对转化反应的影响  42
  4.2 固定化w-PGUS细胞在水/离子液体两相体系中的催化反应  42-47
    4.2.1 固定化材料的筛选  42-43
    4.2.2 [Bmim]PF_6加入比例对固定化细胞转化反应的影响  43-44
    4.2.3 缓冲液pH对固定化细胞转化反应的影响  44-45
    4.2.4 反应温度对固定化细胞转化反应的影响  45
    4.2.5 底物浓度对固定化细胞转化反应的影响  45-46
    4.2.6 两相体系中底物和产物的分配  46-47
    4.2.7 固定化细胞和离子液体的重复利用  47
  4.3 小结  47-49
第5章 水/离子液体两相体系中重组毕赤酵母全细胞转化甘草酸  49-56
  引言  49
  5.1 水/离子液体体积比的影响  49-50
  5.2 两相体系中底物和产物的分配  50-51
  5.3 缓冲液pH的影响  51-52
  5.4 反应温度的影响  52
  5.5 底物浓度的影响  52-53
  5.6 细胞加入量和反应时间的影响  53-54
  5.7 最优条件下催化反应  54
  5.8 离子液体的重复利用  54-55
  5.10 小结  55-56
第6章 离子液体对β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性及结构功能的影响  56-68
  引言  56
  6.1 离子液体对β-葡萄糖醛酸苷酶的催化特性的影响  56-62
    6.1.1 离子液体的浓度对酶催化反应的影响  56-57
    6.1.2 离子液体对酶催化反应最适pH值的影响  57-58
    6.1.3 离子液体对酶催化最适反应温度的影响  58-59
    6.1.4 离子液体对酶催化最适反应底物浓度的影响  59-60
    6.1.5 反应动力学常数K_m及最大反应速度V_(max)  60-61
    6.1.6 反应表观活化能的确定  61-62
  6.2 离子液体对β-葡萄糖醛酸苷酶结构和功能的影响  62-67
    6.2.1 重组β-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化过程  62
    6.2.2 Ni-NTA Sepharose亲和层析  62-63
    6.2.3 β-葡萄糖醛酸苷酶纯度鉴定  63-64
    6.2.4 Sephadex G-25凝胶过滤层析  64
    6.2.5 含离子液体介质中β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光光谱  64-65
    6.2.6 圆二色谱二级构象分析  65-67
  6.3 小结  67-68
第7章 结论与展望  68-70
  7.1 结论  68-69
  7.2 展望  69-70
参考文献  70-78
致谢  78-79
作者简介  79-80
导师评阅表  80

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 一般性问题 > 基础理论
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