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脂多糖和枯草芽孢杆菌对草鱼免疫相关基因表达的影响

作　者: 彭小云
导　师: 吴志新
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 枯草芽孢杆菌 脂多糖 草鱼 免疫相关基因 嗜水气单胞菌
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,研究脂多糖(LPS)对草鱼的毒性及LPS和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对草鱼免疫相关基因表达的影响。1.腹腔注射给一龄健康草鱼大肠杆菌LPS(E-LPS)(剂量为0mg/kg.4mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg、65mg/kg、80mg/kg),进行毒性试验。将孵化2d草鱼苗置于E-LPS溶液中,浓度依次为1000μg/mL、800μg/mL、500μg/mL、200μg/mL、100μg/mL和0μg/mL进行毒性试验。结果表明：观察一龄草鱼14d,未见有草鱼死亡或其他异常状况,说明E-LPS对一龄草鱼几乎无毒性；但是对于草鱼苗50-500μg/mL E-LPS浸泡时死亡率较低,1000μg/mL浸泡72h死亡率为100%,计算得出48hLD50为489.24μg/mL,说明草鱼苗对E-LPS有很强的耐受性,说明E-LPS浸泡草鱼苗后,其对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒产生较强抵抗,实验组草鱼苗免疫保护率都在70%以上。2.将嗜水气单胞菌粗脂多糖(C-LPS)和大肠杆菌脂多糖(E-LPS)分别经注射草鱼腹腔(剂量为4mg/kg),以注射PBS为对照组。48h后,分别提取各组草鱼头肾、脾脏、肾脏、肝脏和肠组织总RNA,Real-time PCR法检测TNF-α、IL-1β、IL-10和TLR4的表达情况。结果显示：在头肾中,E-LPS组TNF-a和IL-1β表达量显著升高,C-LPS组IL-1p显著下降,TLR4的表达水平在两处理组均有显著性降低；脾脏中仅C-LPS组IL-1β的表达显著升高,TLR4在两实验组有显著性降低；肾脏,E-LPS组TNF-a表达显著性升高,C-LPS组IL-1β和IL-10也有显著性升高,TLR4在两实验组与对照组无显著性差异；肝脏TNF-α、IL-10和TLR4在两处理组均有显著性升高,E-LPS组IL-1β的表达显著高于对照组和C-LPS组；肠组织TNF-a在两处理组有显著性降低,IL-1β和TLR4与对照组间无显著性差异。表明C-LPS和E-LPS均可引起草鱼细胞因子基因表达的变化,对于机体免疫反应起到一定的调节作用,但LPS对TLR4基因并没有引起显著的上调作用,这与哺乳类动物的研究结果不同。3.将草鱼随机分成两组：一组投喂基础饲料(Con组),另一组投喂添加有1x109cell/kg的枯草芽孢杆菌饲料(B.s组)。投喂28d后,将两组草鱼各随机分别分作3组,注射PBS、A. hydrophila和E-LPS,并于不同时间点分别检测TNF-a. IL-1β、IL-10和TLR4基因在草鱼头肾、脾脏、肾脏、肝脏以及肠组织中的表达量。结果显示,投喂28d后,B.s组TNF-α、IL-1β和TLR4基因在所选各组织中的表达量显著升高：IL-10在头肾、脾脏、肝脏中的表达量显著升高,而在肠中的表达显著性下降。相比对照组B.s组在注射A.h后死亡率较低；在各时间点,与Con+A.h组相比,B. s+A. h组所选组织IL-10表达量均有显著性上升；而除肠组织外,其它组织中TNF-α、IL-1β的表达量有显著性地下降,说明枯草芽孢杆菌能够抑制或降低嗜水气单胞菌引起的炎症反应。注射E-LPS后1h和6h时,B. s+LPS组头肾、脾脏和肾脏中TNF-a和IL-10基因的表达量均显著高于Con+LPS组,24h时TNF-a和IL-10表达量与Con+LPS组无显著变化或是表达量下降；Con+LPS组各组织TLR4表达量较稳定,而在B. s+LPS组,其表达量显著高于Con+LPS组。肝脏B. s+LPS组TNF-a表达量仅在6h时显著升高,IL-10的表达量6h和24h显著降低。肠组织TNF-a在1h时出现表达高峰;IL-10和TLR4表达量在1h和6h的表达量均高于Con+LPS组。这些结果说明枯草芽孢杆菌能够诱导E-LPS对机体细胞因子的快速调节,LPS也能促进投喂芽孢杆菌组草鱼的免疫应答水平。同时研究发现,LPS不能直接引起TLR4表达水平发生变化,而投喂芽孢杆菌后,能够诱导TLR4的表达,但对具体的机制还不是很清楚,有待进一步的研究。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-12
縮略语  12-13
第一章 文献综述  13-26
  1 益生菌及其作用  13-15
    1.1 益生菌在水产中的应用  13
    1.2 益生菌与动物免疫  13-15
      1.2.1 益生菌对鱼类的免疫调节作用  13-14
      1.2.2 益生菌对肠道免疫的调节  14-15
      1.2.3 影响益生菌免疫调节作用的因素  15
    1.3 益生菌与疾病防治  15
  2 芽孢杆菌在水产养殖中的作用  15-18
    2.1 对水质的调节和育苗的影响  16
    2.2 促进机体生长性能和肠道消化酶的产生  16-17
    2.3 提高机体免疫力,促进抗病力  17-18
  3 脂多糖(LPS)  18-21
    3.1 LPS的生物学活性  18
    3.2 LPS对鱼类的毒性  18-19
    3.3 鱼类LPS的吸收  19
    3.4 LPS在鱼类免疫中的作用  19-21
      3.4.1 对白细胞或淋巴细胞的影响  19-20
      3.4.2 对巨噬细胞的影响  20
      3.4.3 对抗体反应的调节  20-21
    3.5 LPS的免疫刺激活性  21
  4 鱼类细胞因子简介  21-24
    4.1 白细胞介素  21-23
    4.2 肿瘤坏死因子  23-24
  5 Toll样受体(TLRs)研究  24-25
  6 本研究目的和意义  25-26
第二章 LPS对草鱼的毒性及其免疫保护作用  26-31
  1 材料和方法  26-27
    1.1 实验材料  26
    1.2 E-LPS对草鱼的毒性  26-27
      1.2.1 E-LPS对一龄健康草鱼的毒性  26-27
      1.2.2 E-LPS对草鱼苗的毒性  27
    1.3 E-LPS对草鱼苗的免疫保护性  27
      1.3.1 浸泡免疫  27
      1.3.2 嗜水气单胞菌攻毒试验  27
    1.4 数据分析  27
  2 结果与分析  27-29
    2.1 E-LPS对草鱼的毒性  27-28
    2.2 E-LPS的免疫活性  28-29
  3 讨论  29-31
第三章 两种细菌LPS对草鱼免疫相关基因表达的影响  31-41
  1 材料与方法  31-35
    1.1 实验鱼及饲养  31
    1.2 LPS  31-32
    1.3 分组与注射  32
    1.4 取样  32
    1.5 总RNA的提取  32-33
      1.5.1 匀浆  32
      1.5.2 分离  32-33
      1.5.3 RNA沉淀  33
      1.5.4 RNA洗脱  33
      1.5.5 RNA溶解  33
    1.6 cDNA合成  33-34
      1.6.1 基因组DNA的去除反应  33
      1.6.2 反转录反应  33-34
    1.7 Real-Time PCR  34
    1.8 数据分析  34-35
  2 结果  35-38
    2.1 RNA质量的检测  35
    2.2 反转录效果的检测  35-36
    2.3 头肾中各基因的表达  36
    2.4 脾脏中各基因的表达  36
    2.5 肾脏中各基因的表达  36
    2.6 肝脏中各基因的表达  36
    2.7 肠组织中各基因的表达  36-38
  3 讨论  38-41
第四章 枯草芽孢杆菌对草鱼免疫相关基因表达的影响  41-55
  1 材料与方法  41-43
    1.1 细菌培养  41
    1.2 实验鱼和养殖条件  41-42
    1.3 嗜水气单胞菌攻毒  42
    1.4 感染嗜水气单胞菌和注射E-LPS  42-43
      1.4.1 取样  42-43
      1.4.2 注射嗜水气单胞菌和E-LPS  43
    1.5 提取组织RNA及Real-time PCR分析  43
    1.6 数据分析  43
  2 结果与分析  43-51
    2.1 死亡率  43
    2.2 投喂枯草芽孢杆菌后细胞因子及TLR4表达的变化  43-45
    2.3 感染嗜水气单胞菌后细胞因子及TLR4的表达  45-48
    2.4 注射E-LPS后细胞因子及TLR4的表达  48-51
  3 讨论  51-55
    3.1 枯草芽孢杆菌对细胞因子和TLR4的调节  51-52
    3.2 枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌感染后细胞因子和TLR4的影响  52-53
    3.3 枯草芽孢杆菌对注射E-LPS后细胞因子和TLR4的调节作用  53-55
参考文献  55-70
附录  70-71
  硕士期间发表的论文  70-71
致谢  71

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