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团头鲂Kiss2/Kiss2R系统对其生殖调控的初步研究

作　者: 温久福
导　师: 王卫民
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 团头鲂 Kiss2 Kiss2R 基因克隆和表达性腺发育
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

团头鲂是我国特有的重要草食性经济鱼类之一。动物的性成熟表现为一个复杂的调控过程,通过下丘脑—脑垂体—性腺(Hypothalamic-Pituitary-Gonad, HPG)这个生殖内分泌调控轴来调控其性腺发育和成熟。已经发现KiSS-1/KissR基因的突变与人和鼠的性早熟是密切相关的。然而Kiss-1/KissR基因在鱼类性早熟中是否起到了一定的调控作用还不是很清楚。本研究通过末端快速扩增技术(RACE)克隆了团头鲂Kiss2/Kiss2R基因的cDNA序列全长,并应用荧光定量PCR技术检测团头鲂Kiss2/Kiss2R在团头鲂雌雄组织的表达模式；分析了Kiss2/Kiss2R在团头鲂胚胎发育时期以及仔稚鱼时期的表达变化；最后通过组织切片鉴定了团头鲂不同发育时期的性腺分期；通过荧光定量PCR进行了雌雄团头鲂性腺分化不同时期,Kiss2/Kiss2R在脑、垂体、性腺的表达情况。期望通过本研究明确团头鲂Kiss2/Kiss2R在生殖调控中的作用,为揭示团头鲂性早熟分子机制提供参考,同时为筛选团头鲂生殖内分泌调控相关功能基因提供基础信息。主要研究结果如下：(1)克隆出团头鲂Kiss2/Kiss2R cDNA序列全长,与其它物种Kiss/KissR同源基因氨基酸序列构建的系统进化树分析表明团头鲂Kiss/KissR基因应属Kiss2/Kiss2R.其中Kiss2基因cDNA全长623bp,开放阅读框包含378bp,编码125个氨基酸,5’非翻译序列49bp,3’非翻译序列196bp。其编码的氨基酸与金鱼、斑马鱼的同源性比较显示其相似度大于80%,并发现其核心功能结构域FNYNPFGLRF,以及一个C末端剪切位点GKR位点,并具有一个多聚腺苷酸尾巴。(2) Kiss2R cDNA序列全长1176bp,开放阅读框573bp,编码190个氨基酸,5端非翻译序列161bp,3端非翻译序列为442bp。但是并没有发现G蛋白偶联受体家族具有7个跨膜结构域,而只预测到2个。在团头鲂Kiss2R序列发现2个多聚腺苷酸加尾信号序列(AATAAA),因此团头鲂Kiss2R基因可能存在选择性剪切机制,其结构也含有一个多聚腺苷酸尾巴。(3)团头鲂Kiss2/Kiss2R基因的组织表达具有广泛性。雄性团头鲂Kiss2表达量最高的是肌肉,其次是卵巢和中脑,肠、心脏、肝脏表现出中等表达水平；雌性表达量最高的也是肌肉组织,然后是垂体和精巢；Kiss2R在雌性和雄性团头鲂的肌肉组织表达量也是最高的,并且卵巢的表达量高于精巢；KissR也是在生殖轴相关组织具有较高表达量。(4)在成熟的精子和卵细胞中的Kiss2/Kiss2R系统处于激活状态,随后的过程表达量出现下降趋势。Kiss2基因在受精卵发育到囊胚期时表达量出现峰值,然而Kiss2R表达量却很低；Kiss2R基因在出膜15天后的表达量出现峰值,Kiss2的表达量也较低。但是,Kiss2/Kiss2R在出膜时期的表达都是低水平的。总体来讲,Kiss2/Kiss2R的表达趋势还是一致的,并且其表达量一直处于波动状态,不断地升高和降低。表达量在不同基因以及不同发育时期都有显著性差异。(5)组织切片观察明确鉴别出团头鲂卵巢和精巢发育第Ⅰ期至第Ⅵ期的性腺组织结构。Kiss2在雄鱼性腺不同发育时期对应的脑和垂体组织中的表达变化趋势基本一致,在Ⅱ期和Ⅴ期出现峰值,精巢的表达量在Ⅲ期表达量出现最大值；而在雌鱼卵巢/垂体和脑组织中表达模式一致,都是在性腺发育Ⅱ期时表达量最高；并且Kiss2在雌雄个体脑和垂体组织中的表达模式类似。Kiss2R在雄鱼性腺发育Ⅰ期的脑和垂体的表达量较高,此后一直下降,但是在精巢组织中的表达却处于不断的波动状态,并在Ⅲ期表达量出现最大值；在雌鱼脑和垂体的表达变化较为明显,脑和垂体在Ⅱ期和Ⅵ期表达较高；而在卵巢组织中一直比较平稳。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
縮略语表  10-11
第一章文献综述  11-23
  1 前言  11
  2 Kiss/KissR系统研究进展  11-22
    2.1 Kiss/KissR基因的分子特征和进化分析  11-13
    2.2 Kisspeptin以及KissR神经元定位和组织表达分布研究进展  13-15
    2.3 Kiss/KissR系统的性别差异  15
    2.4 Kiss/KissR生殖调控研究进展  15-22
  3 本研究的目的和意义  22-23
第二章团头鲂Kiss2/Kiss2R基因的cDNA全长克隆  23-46
  1 前言  23
  2 材料与方法  23-30
    2.1 实验动物  23
    2.2 主要仪器  23-24
    2.3 主要试剂及药品  24-25
    2.4 总RNA的提取  25
    2.5 引物设计和合成  25-26
    2.6 3'RACE扩增团头鲂Kiss/KissR基因的3'末端  26-27
    2.7 5'RACE扩增团头鲂Kiss/KissR基因的5'末端  27-29
    2.8 序列分析  29-30
  3 结果与分析  30-44
    3.1 团头鲂RACE扩增结果  30
    3.2 团头鲂Kiss2/Kiss2R基因cDNA全长序列的分析  30-35
    3.3 团头鲂Kiss2/Kiss2R基因与其它物种的同源比对及系统进化分析  35-38
    3.4 团头鲂Kiss2/Kiss2R基因编码蛋白的生物信息学分析  38-44
  4 讨论  44-46
    4.1 团头鲂Kiss2/Kis2R氨基酸序列分析  44-45
    4.2 团头鲂Kiss2/Kiss2R进化地位讨论  45-46
第三章团头鲂Kiss2/Kiss2R基因的表达分析  46-55
  1 材料和方法  46-50
    1.1 组织材料  46
    1.2 主要仪器  46
    1.3 主要试剂和药品  46-47
    1.4 表达引物  47
    1.5 总RNA的提取  47
    1.6 cDNA的合成  47-48
    1.7 引物设计和筛选  48-49
    1.8 标准曲线构建  49
    1.9 荧光定量PCR反应  49-50
    1.10 数据处理  50
  2 结果  50-53
    2.1 总RNA提取  50-51
    2.2 引物扩增结果  51
    2.3 目的基因在不同组织表达水平的定量结果分析  51-53
  3 讨论  53-55
第四章团头鲂性腺发育不同时期组织学观察及Kiss2/Kiss2R基因表达分析  55-65
  1 前言  55
  2 材料和方法  55-58
    2.1 试验材料  55-56
    2.2 试验方法  56-58
  3 结果  58-63
    3.1 精巢发育组织结构  59-60
    3.2 卵巢发育组织结构  60-61
    3.3 Kiss2/Kiss2R在性腺不同发育时期的表达  61-63
  4 讨论  63-65
参考文献  65-75
附录  75-76
致谢  76

团头鲂Kiss2/Kiss2R系统对其生殖调控的初步研究

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